Nature.comをご利用いただきありがとうございます。お使いのブラウザのバージョンはCSSのサポートが制限されています。最適な表示のためには、より新しいブラウザをご利用いただくか、Internet Explorerの互換表示モードを無効にすることをお勧めします。当面の間、継続的なサポートを確保するため、スタイルシートとJavaScriptを無効にした状態でサイトを表示いたします。
モーディック変化（MC）の動物モデルの確立は、MCの研究の重要な基礎である。ニュージーランドホワイトウサギ54匹を、偽手術群、筋肉移植群（ME群）、髄核移植群（NPE群）に分けた。NPE群では、前外側腰椎手術アプローチにより椎間板を露出し、針を用いてL5椎体の終板付近を穿刺した。注射器を用いてL1/2椎間板から髄核を抽出し、そこに注入した。軟骨下骨に穴を開けた。筋肉移植群と偽手術群の手術手順と穿孔方法は、髄核移植群と同じであった。ME群では、穴に筋肉片を挿入したが、偽手術群では、穴に何も挿入しなかった。手術後、MRIスキャンと分子生物学的検査を行った。 NPE群ではシグナルに変化が見られたが、偽手術群およびME群では明らかなシグナル変化は認められなかった。組織学的観察では、移植部位に異常な組織増殖が認められ、NPE群ではIL-4、IL-17、およびIFN-γの発現が増加していた。軟骨下骨へのNPの移植は、MCの動物モデルを形成することができる。
Modic変化（MC）は、磁気共鳴画像法（MRI）で確認できる椎体終板および隣接する骨髄の病変です。関連症状のある人によく見られます1。多くの研究が、MCが腰痛（LBP）と関連していることからその重要性を強調しています2,3。de Roosら4とModicら5は、椎体骨髄の軟骨下信号異常の3つの異なるタイプを独立して初めて記述しました。ModicタイプI変化は、T1強調（T1W）シーケンスで低信号、T2強調（T2W）シーケンスで高信号を示します。この病変は、骨髄内の亀裂終板と隣接する血管肉芽組織を示します。ModicタイプII変化は、T1WおよびT2Wシーケンスの両方で高信号を示します。このタイプの病変では、終板の破壊と隣接する骨髄の組織学的脂肪置換が見られます。ModicタイプIII変化は、T1WおよびT2Wシーケンスで低信号を示します。終板に対応する硬化性病変が観察されている6。MCは脊椎の病理学的疾患と考えられており、脊椎の多くの変性疾患と密接に関連している7,8,9。
入手可能なデータを考慮すると、いくつかの研究はMCの病因と病理学的メカニズムについて詳細な洞察を提供している。Albertらは、MCは椎間板ヘルニアによって引き起こされる可能性があると示唆した8。Huらは、MCは重度の椎間板変性によるものだと考えた10。Krocは、「内部椎間板破裂」の概念を提唱し、椎間板の反復的な外傷が終板の微小断裂につながる可能性があると述べた。裂け目形成後、髄核（NP）による終板の破壊が自己免疫反応を引き起こし、それがさらにMCの発症につながる可能性がある11。Maらは同様の見解を共有し、NP誘発性自己免疫がMCの病因において重要な役割を果たしていると報告した12。
免疫系細胞、特にCD4+ Tヘルパーリンパ球は、自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たしている13。最近発見されたTh17サブセットは、炎症性サイトカインIL-17を産生し、ケモカインの発現を促進し、損傷した臓器のT細胞を刺激してIFN-γを産生させる14。Th2細胞もまた、免疫応答の発症に独自の役割を果たしている。代表的なTh2細胞であるIL-4の発現は、重篤な免疫病理学的結果につながる可能性がある15。
MC16,17,18,19,20,21,22,23,24に関する臨床研究は数多く行われてきたが、ヒトで頻繁に発生するMCのプロセスを模倣し、病因や標的療法などの新しい治療法を研究するために使用できる適切な動物実験モデルは依然として不足している。現在までに、MCの根本的な病理学的メカニズムを研究するために報告された動物モデルはごくわずかである。
アルバートとマーが提唱した自己免疫理論に基づき、本研究では、穿孔した椎体終板付近に髄核を自家移植することにより、簡便かつ再現性の高いウサギMCモデルを確立した。その他の目的は、動物モデルの組織学的特徴を観察し、MCの発症における髄核の特異的なメカニズムを評価することである。この目的のために、分子生物学、MRI、組織学的研究などの技術を用いてMCの進行を研究する。
手術中に2匹のウサギが出血死し、MRI検査中の麻酔中に4匹のウサギが死亡した。残りの48匹のウサギは生存し、手術後、行動面や神経系の異常は認められなかった。
MRIでは、異なる穴に埋め込まれた組織の信号強度が異なることが示されています。NPEグループのL5椎体の信号強度は、挿入後12、16、20週で徐々に変化しました（T1Wシーケンスでは低信号、T2Wシーケンスでは混合信号と低信号が示されました）（図1C）。一方、他の2つのグループの埋め込まれた部分のMRI所見は、同じ期間に比較的安定していました（図1A、B）。
（A）ウサギの腰椎の3つの時点における代表的な連続MRI画像。偽手術群の画像には信号異常は見られなかった。（B）ME群の椎体の信号特性は偽手術群と同様であり、埋め込み部位では経時的に有意な信号変化は観察されなかった。（C）NPE群では、T1Wシーケンスで低信号がはっきりと見え、T2Wシーケンスで混合信号と低信号がはっきりと見える。12週目から20週目にかけて、T2Wシーケンスの低信号を取り囲む散発的な高信号は減少した。
NPE群では椎体の移植部位に明らかな骨増殖が見られ、骨増殖は12週から20週にかけてより速く進行する（図2C）。NPE群では、モデル化された椎体には有意な変化は見られなかった。Sham群およびME群（図2C）2A、B）。
（A）移植部位の椎体表面は非常に滑らかで、穴は良好に治癒しており、椎体内に骨増殖は見られない。（B）ME群の移植部位の形状は偽手術群と同様であり、移植部位の外観に経時的な明らかな変化は見られない。（C）NPE群の移植部位に骨増殖が見られた。骨増殖は急速に進行し、椎間板を貫通して反対側の椎体まで広がった。
組織学的分析により、骨形成に関するより詳細な情報が得られる。図3は、H&E染色した術後切片の写真である。偽手術群では、軟骨細胞は整然と配列しており、細胞増殖は認められなかった（図3A）。ME群の状況は偽手術群と同様であった（図3B）。しかし、NPE群では、移植部位に多数の軟骨細胞とNP様細胞の増殖が観察された（図3C）。
（A）終板付近に骨梁が見られ、軟骨細胞は均一な細胞サイズと形状で整然と配列しており、増殖は見られない（40倍）。（B）ME群の移植部位の状態は、シャム群と同様である。骨梁と軟骨細胞が見られるが、移植部位に明らかな増殖は見られない（40倍）。（B）軟骨細胞とNP様細胞が著しく増殖しており、軟骨細胞の形状とサイズが不均一であることがわかる（40倍）。
インターロイキン4（IL-4）mRNA、インターロイキン17（IL-17）mRNA、およびインターフェロンγ（IFN-γ）mRNAの発現は、NPE群とME群の両方で観察された。標的遺伝子の発現レベルを比較すると、NPE群ではME群および偽手術群と比較して、IL-4、IL-17、およびIFN-γの遺伝子発現が有意に増加していた（図4）（P < 0.05）。偽手術群と比較すると、ME群ではIL-4、IL-17、およびIFN-γの発現レベルはわずかに増加しただけで、統計的に有意な変化は認められなかった（P > 0.05）。
NPE群におけるIL-4、IL-17、IFN-γのmRNA発現は、偽手術群およびME群と比較して有意に高い傾向を示した（P < 0.05）。
対照的に、ME群における発現レベルには有意差は認められなかった（P>0.05）。
IL-4およびIL-17に対する市販の抗体を用いてウェスタンブロット解析を行い、mRNA発現パターンの変化を確認した。図5A、Bに示すように、ME群および偽手術群と比較して、NPE群ではIL-4およびIL-17のタンパク質レベルが有意に増加した（P < 0.05）。偽手術群と比較して、ME群ではIL-4およびIL-17のタンパク質レベルに統計的に有意な変化は認められなかった（P > 0.05）。
（A）NPE群におけるIL-4およびIL-17のタンパク質レベルは、ME群およびプラセボ群よりも有意に高かった（P < 0.05）。（B）ウェスタンブロットヒストグラム。
手術中に得られるヒト検体の数が限られているため、MCの病因に関する明確かつ詳細な研究はやや困難である。我々は、MCの潜在的な病理学的メカニズムを研究するために、MCの動物モデルを確立しようと試みた。同時に、NP自家移植によって誘発されたMCの経過を追跡するために、放射線学的評価、組織学的評価、および分子生物学的評価が用いられた。その結果、NP移植モデルでは、12週から20週の時点で信号強度が徐々に変化し（T1強調画像で低信号、T2強調画像で低信号が混在）、組織の変化を示し、組織学的および分子生物学的評価によって放射線学的研究の結果が確認された。
この実験の結果、NPE群では椎体侵害部位で視覚的および組織学的変化が生じたことが示された。同時に、IL-4、IL-17、IFN-γ遺伝子の発現、およびIL-4、IL-17、IFN-γの発現が観察され、椎体内の自家髄核組織の侵害が一連の信号および形態学的変化を引き起こす可能性があることが示された。動物モデルの椎体の信号特性（T1Wシーケンスでは低信号、T2Wシーケンスでは混合信号および低信号）はヒト椎体細胞の信号特性と非常によく似ていることが容易に確認でき、MRI特性も組織学および肉眼解剖学の観察結果、すなわち椎体細胞の変化が進行性であることを裏付けている。急性外傷による炎症反応は穿刺後すぐに現れる可能性があるものの、MRI検査の結果、穿刺後12週間で信号変化が徐々に増加し、20週間まで回復やMRI変化の逆転の兆候が見られずに持続することが示された。これらの結果は、自家椎骨髄球移植がウサギにおける進行性MVを確立するための信頼できる方法であることを示唆している。
この穿刺モデルには、十分な技術、時間、および外科的努力が必要です。予備実験では、傍脊椎靭帯構造の解剖または過度の刺激により、椎骨骨棘の形成が生じる可能性があります。隣接する椎間板を損傷または刺激しないように注意する必要があります。一貫性のある再現可能な結果を得るためには穿刺深度を制御する必要があるため、長さ3 mmの針の鞘を切り取って手動でプラグを作成しました。このプラグを使用することで、椎体内の穿孔深度を均一にすることができます。予備実験では、手術に関与した3人の整形外科医が、18ゲージ針や他の方法よりも16ゲージ針の方が扱いやすいと感じました。穿孔中の過度の出血を避けるため、針をしばらく静止させておくと、より適切な挿入孔が得られるため、この方法で一定程度のMCを制御できることが示唆されます。
多くの研究がMCを対象としていますが、MCの病因と病態生理についてはほとんど知られていません25,26,27。私たちの以前の研究に基づくと、自己免疫がMCの発生と発達に重要な役割を果たしていることがわかりました12。この研究では、抗原刺激後のCD4+細胞の主な分化経路であるIL-4、IL-17、およびIFN-γの定量的発現を調べました。私たちの研究では、陰性群と比較して、NPE群ではIL-4、IL-17、およびIFN-γの発現が高く、IL-4およびIL-17のタンパク質レベルも高くなりました。
臨床的には、椎間板ヘルニア患者のNP細胞ではIL-17 mRNAの発現が増加しています28。急性非圧迫性椎間板ヘルニアモデルでは、健常対照群と比較してIL-4およびIFN-γの発現レベルが増加していることも確認されています29。IL-17は炎症、自己免疫疾患における組織損傷において重要な役割を果たし、30 IFN-γに対する免疫応答を増強します31。MRL/lprマウス32および自己免疫感受性マウス33では、IL-17を介した組織損傷の増強が報告されています。IL-4は、炎症性サイトカイン（IL-1βやTNFαなど）の発現およびマクロファージの活性化を阻害することができます34。NPE群では、IL-4のmRNA発現がIL-17およびIFN-γと同時点で異なっていたことが報告されています。NPE群のIFN-γのmRNA発現は、他の群よりも有意に高かった。したがって、IFN-γの産生はNPの挿入によって誘発される炎症反応のメディエーターである可能性がある。研究によると、IFN-γは活性化された1型ヘルパーT細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージなど複数の細胞種によって産生され35,36、免疫応答を促進する重要な炎症促進性サイトカインである37。
この研究は、自己免疫反応がMCの発生と発達に関与している可能性を示唆している。Luomaらは、MCと顕著なNPの信号特性がMRI上で類似しており、両方ともT2Wシーケンスで高信号を示すことを発見した38。IL-13などのいくつかのサイトカインは、MCの発生と密接に関連していることが確認されている9。Maらは、NPの上方または下方への突出がMCの発生と発達に大きな影響を与える可能性があることを示唆した12。Bobechko40とHerzbeinら41は、NPは出生時から血管循環に入ることができない免疫寛容組織であると報告した。NPの突出は血液供給に異物を導入し、それによって局所的な自己免疫反応を媒介する42。自己免疫反応は多数の免疫因子を誘導することができ、これらの因子が組織に継続的に曝露されると、シグナル伝達の変化を引き起こす可能性がある43。この研究では、IL-4、IL-17、IFN-γの過剰発現は典型的な免疫因子であり、NPとMCの密接な関係をさらに証明しています44。この動物モデルは、NPの突破と終板への侵入をよく模倣しています。このプロセスは、自己免疫がMCに及ぼす影響をさらに明らかにしました。
予想通り、この動物モデルはMCを研究するためのプラットフォームとして利用できる可能性があります。しかし、このモデルにはいくつかの限界があります。まず、動物観察段階では、組織学的および分子生物学的検査のために中間段階のウサギを安楽死させる必要があるため、時間の経過とともに一部の動物が「使用不能」になります。次に、この研究では3つの時点を設定していますが、残念ながら、MCのタイプは1つ（ModicタイプIの変化）しかモデル化していないため、ヒトの疾患の発症過程を十分に表現できておらず、すべてのシグナル変化をよりよく観察するためには、より多くの時点を設定する必要があります。第三に、組織構造の変化は組織学的染色によって確かに明確に示せますが、このモデルでは、より特殊な技術を用いることで微細構造の変化をよりよく明らかにすることができます。例えば、偏光顕微鏡を用いてウサギの椎間板における線維軟骨の形成を分析しました45。NPのMCおよび終板への長期的な影響については、さらなる研究が必要です。
体重約2.5～3kg、月齢3～3.5ヶ月の雄ニュージーランドホワイトウサギ54匹を、偽手術群、筋肉移植群（ME群）、神経根移植群（NPE群）に無作為に分けました。すべての実験手順は天津病院倫理委員会の承認を得ており、実験方法は承認されたガイドラインに厳密に従って実施されました。
S. Sobajima 46 の手術手技にいくつかの改良が加えられた。各ウサギを横臥位にし、後外側後腹膜アプローチを用いて連続する 5 つの腰椎椎間板 (IVD) の前表面を露出させた。各ウサギに全身麻酔 (20% ウレタン、5 ml/kg を耳静脈から投与) を施した。肋骨の下縁から骨盤縁まで、傍脊椎筋の腹側 2 cm の位置に縦方向の皮膚切開を行った。L1 から L6 までの右前外側脊椎を、その上にある皮下組織、後腹膜組織、および筋肉を鋭利および鈍的に剥離して露出させた (図 6A)。椎間板レベルは、L5-L6 椎間板レベルの解剖学的ランドマークとして骨盤縁を用いて決定した。 16ゲージの穿刺針を用いて、L5椎骨の終板付近に深さ3mmの穴を開ける（図6B）。5mlシリンジを用いて、L1-L2椎間板内の自家髄核を吸引する（図6C）。各グループの要件に応じて、髄核または筋肉を除去する。穿孔穴が深くなったら、手術中に椎体の骨膜組織を損傷しないように注意しながら、深筋膜、浅筋膜、皮膚に吸収性縫合糸をかける。
（A）後外側後腹膜アプローチによりL5-L6椎間板を露出させる。（B）16ゲージ針を用いてL5終板付近に穴を開ける。（C）自家MFを採取する。
全身麻酔として、耳介静脈から20%ウレタン（5ml/kg）を投与し、術後12週、16週、20週に腰椎のX線撮影を繰り返した。
手術後12、16、20週目に、ウサギにケタミン（25.0 mg/kg）を筋肉内注射し、ペントバルビタールナトリウム（1.2 g/kg）を静脈内注射して安楽死させた。脊髄全体を摘出し、組織学的解析を行った。免疫因子の変化を検出するために、定量的逆転写PCR（RT-qPCR）とウェスタンブロット法を用いた。
3.0 T 臨床用磁石 (GE Medical Systems、Florence、SC) と直交肢コイル受信機を使用してウサギの MRI 検査を実施した。ウサギは耳静脈から 20% ウレタン (5 mL/kg) で麻酔し、その後、5 インチ径の円形表面コイル (GE Medical Systems) の中央に腰部を置いた状態で磁石内に仰向けに置いた。L3–L4 から L5–L6 までの腰椎椎間板の位置を定義するために、冠状 T2 強調ローカライザー画像 (TR、1445 ms、TE、37 ms) を取得した。矢状面 T2 強調スライスは、次の設定で取得した: 繰り返し時間 (TR) 2200 ms、エコー時間 (TE) 70 ms の高速スピンエコーシーケンス、マトリックス; 視野 260、刺激 8 つ;切断厚さは2mm、ギャップは0.2mmでした。
最後の写真撮影と最後のウサギの屠殺後、偽手術、筋肉包埋、およびNPディスクを組織学的検査のために摘出した。組織は10%中性緩衝ホルマリンで1週間固定し、エチレンジアミン四酢酸で脱灰し、パラフィン切片を作成した。組織ブロックをパラフィンに包埋し、ミクロトームを用いて矢状断切片（厚さ5μm）に切断した。切片はヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色を行った。
各グループのウサギから椎間板を採取した後、製造元の指示に従ってUNIQ-10カラム（上海桑尼生物科技有限公司、中国）とImProm II逆転写システム（Promega Inc.、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を使用して総RNAを抽出した。逆転写を行った。
RT-qPCRは、製造元の指示に従って、Prism 7300（Applied Biosystems Inc.、米国）とSYBR Green Jump Start Taq ReadyMix（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）を使用して実施した。PCR反応容量は20 μlで、希釈したcDNA 1.5 μlと各プライマー0.2 μMが含まれていた。プライマーはOligoPerfect Designer（Invitrogen、バレンシア、カリフォルニア州）で設計され、Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd.（中国）で製造された（表1）。以下のサーマルサイクリング条件を使用した：94℃で2分間の初期ポリメラーゼ活性化ステップ、その後、テンプレート変性のために94℃で15秒間、60℃で1分間のアニーリング、伸長、蛍光測定を72℃で1分間行うサイクルを40回繰り返した。すべてのサンプルは3回増幅され、その平均値がRT-qPCR解析に使用された。増幅データはFlexStation 3（Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州、米国）を用いて解析された。IL-4、IL-17、およびIFN-γ遺伝子発現は、内在性コントロール（ACTB）に対して正規化された。標的mRNAの相対発現レベルは、2-ΔΔCT法を用いて算出された。
RIPA溶解バッファー（プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む）中で組織ホモジナイザーを使用して組織から総タンパク質を抽出し、4℃で13,000 rpmで20分間遠心分離して組織破片を除去した。各レーンに50マイクログラムのタンパク質をロードし、10% SDS-PAGEで分離した後、PVDFメンブレンに転写した。ブロッキングは、0.1% Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水（TBS）中の5%脱脂粉乳で室温で1時間行った。メンブレンをウサギ抗デコリン一次抗体（1:200希釈；Boster、武漢、中国）（1:200希釈；Bioss、北京、中国）とともに4℃で一晩インキュベートし、2日目に反応させた。二次抗体（ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG、1:40,000希釈）と西洋ワサビペルオキシダーゼ（Boster社、中国武漢）を室温で1時間反応させた。ウェスタンブロットシグナルは、X線照射後の化学発光膜上の化学発光の増加によって検出された。デンシトメトリー解析では、ブロットをスキャンしてBandScanソフトウェアで定量化し、結果は標的遺伝子の免疫反応性とチューブリンの免疫反応性の比として表した。
統計計算はSPSS16.0ソフトウェアパッケージ（SPSS社、米国）を用いて行った。研究中に収集したデータは平均値±標準偏差（平均値±SD）で表し、2群間の差を判定するために一元配置反復測定分散分析（ANOVA）を用いて解析した。p値が0.05未満の場合を統計的に有意とした。
したがって、自家骨髄球を椎体に移植し、肉眼解剖学的観察、MRI分析、組織学的評価、分子生物学的分析を行うことでMCの動物モデルを確立することは、ヒトMCのメカニズムを評価・理解し、新たな治療法を開発するための重要なツールとなる可能性がある。
この記事の引用方法：Han, C. et al. 自家髄核を腰椎軟骨下骨に移植することにより、Modic変化の動物モデルを確立した。Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., and Boos, N. 腰椎の磁気共鳴画像診断：無症状のボランティアにおける椎間板ヘルニアと椎間板遺残、神経根圧迫、終板異常、および椎間関節変形性関節症の有病率。Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, and Leboeuf-Eed, K. Modic変化と臨床所見との関係。European Spine Journal: official publication of the European Spine Society, the European Society of Spinal Deformity, and the European Society for Cervical Spine Research 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. 腰椎終板のModic変化：中年男性労働者における有病率と腰痛および坐骨神経痛との関連。Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A.、Kressel, H.、Spritzer, K.、および Dalinka, M. 腰椎変性疾患における終板近傍の骨髄変化のMRI。AJR. American Journal of Radiology 149、531–534、doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987)。
Modic, MT、Steinberg, PM、Ross, JS、Masaryk, TJ、Carter, JR「変性椎間板疾患：MRIによる椎骨骨髄変化の評価」Radiology 166、193–199、doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988)。
Modic, MT、Masaryk, TJ、Ross, JS、Carter, JR「変性椎間板疾患の画像診断」Radiology 168、177–186、doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988)。
Jensen, TS, et al. 一般集団における新生椎体終板（Modic）信号変化の予測因子。European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Society of Spinal Deformity, and the European Society for Cervical Spine Research, Division 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB および Mannisch, K. 腰椎椎間板ヘルニア後の Modic 変化。European Spine Journal : Official Publication of the European Spine Society, the European Society of Spinal Deformity and the European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., and Kaapa, E. ModicタイプIの変化は急速に進行する変形性椎間板変性を予測できる：1年間の前向き研究。European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ、Zhao, FD、Fang, XQ、Fan, SW Modic変化：腰椎椎間板変性の可能性のある原因と寄与。Medical Hypotheses 73、930–932、doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009)。
Krok, HV 椎間板内破裂。50年以上にわたる椎間板ヘルニアの問題。Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
投稿日時：2024年12月13日