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MOD変化(MC)の動物モデルの確立は、MCを研究するための重要な基礎です。 54個のニュージーランドの白いラビットは、偽術群、筋肉着床群(MEグループ)、および脊髄核移植群(NPEグループ)に分けられました。 NPEグループでは、椎間板が前外側腰椎外科アプローチによって露出し、針を使用して、末端プレートの近くのL5椎体に穴を開けました。 NPは、注射器でL1/2椎間板から抽出され、注入しました。軟骨下骨に穴を開ける。筋肉移植群および偽術グループの外科的処置と掘削方法は、NP移植群のものと同じでした。 MEグループでは、筋肉の断片が穴に入れられ、偽術グループでは穴には何も置かれていませんでした。手術後、MRIスキャンと分子生物学的検査が実施されました。 NPEグループの信号は変化しましたが、偽術グループとMEグループに明らかな信号の変化はありませんでした。組織学的観察により、移植部位で異常な組織増殖が観察され、NPEグループでIL-4、IL-17およびIFN-γの発現が増加したことが示されました。 NPの軟骨下骨への着床は、MCの動物モデルを形成できます。
MODICの変化(MC)は、脊椎共鳴画像法(MRI)に見える椎骨のエンドプレートと隣接する骨髄の病変です。それらは、関連する症状を持つ個人で非常に一般的です1。多くの研究では、腰痛(LBP)2,3との関連により、MCの重要性が強調されています。 de Roos et al.4およびModic et al.5は、椎骨骨髄の3つの異なるタイプの3つの異なる軟骨下信号異常を独立して最初に説明しました。 T1強調(T1W)シーケンスでは、タイプIのタイプの変化は低強度であり、T2強調(T2W)シーケンスでハイパーインターンスです。この病変は、骨髄の裂け目のエンドプレートと隣接する血管肉肉組織を明らかにします。 MODIC TYPE IIの変更は、T1WとT2Wの両方のシーケンスで高い信号を示しています。このタイプの病変では、エンドプレートの破壊が見られ、隣接する骨髄の組織学的脂肪交換が見られます。 MODIC型IIIの変更T1WおよびT2Wシーケンスで低信号が表示されます。エンドプレートに対応する硬化性病変が観察されています6。 MCは脊椎の病理学的疾患と見なされており、脊椎の多くの変性疾患と密接に関連しています7,8,9。
利用可能なデータを考慮して、いくつかの研究により、MCの病因と病理学的メカニズムに関する詳細な洞察が提供されています。アルバート等。 MCはディスクヘルニアによって引き起こされる可能性があることを示唆しました8。 Hu et al。 MCを重度の椎間板変性に起因しました10。 KROCは、「内部椎間板破裂」の概念を提案しました。これは、繰り返しのディスクの外傷がエンドプレートのマイクロチアルにつながる可能性があると述べています。裂け目形成後、脊髄核(NP)によるエンドプレート破壊は、自己免疫反応を引き起こす可能性があり、これがさらにMC11の発生につながる可能性があります。 Ma et al。同様の見解を共有し、NP誘発性の自己免疫がMC12の病因に重要な役割を果たすことを報告しました。
免疫系細胞、特にCD4+ Tヘルパーリンパ球は、自己免疫の病因に重要な役割を果たします13。最近発見されたTh17サブセットは、炎症性サイトカインIL-17を生成し、ケモカイン発現を促進し、損傷した臓器のT細胞を刺激してIFN-γ14を産生します。 Th2細胞は、免疫応答の病因にも独自の役割を果たします。代表的なTh2細胞としてのIL-4の発現は、重度の免疫病理学的結果につながる可能性があります15。
MC16,17,18,18,19,20,21,22,23,24については、多くの臨床研究が実施されていますが、人間で頻繁に発生するMCプロセスを模倣できる適切な動物実験モデルがまだ不足しています。標的療法などの病因または新しい治療法の調査に使用されます。これまで、MCの動物モデルは、基礎となる病理学的メカニズムを研究するために報告されています。
AlbertとMAによって提案された自己免疫理論に基づいて、この研究は、掘削された脊椎末端プレートの近くでNPを自動流産することにより、シンプルで再現可能なウサギMCモデルを確立しました。他の目的は、動物モデルの組織学的特性を観察し、MCの開発におけるNPの特定のメカニズムを評価することです。この目的のために、MCの進行を研究するために、分子生物学、MRI、組織学的研究などの技術を使用します。
手術中に2つのウサギが出血で死亡し、MRI中に麻酔中に4つのウサギが死亡しました。残りの48のウサギは生き残り、手術後に行動または神経学的な徴候を示さなかった。
MRIは、異なる穴に埋め込まれた組織の信号強度が異なることを示しています。 NPEグループのL5椎体の信号強度は、挿入後12、16、および20週間で徐々に変化しました(T1W配列は低信号を示し、T2W配列は混合信号と低信号を示しました)(図1C)、MRIは出現します。埋め込まれた部分の他の2つのグループのうち、同じ期間中は比較的安定したままでした(図1a、b)。
(a)3時点でのウサギ腰椎の代表的な連続MRI。偽術グループの画像には、信号の異常は見つかりませんでした。 (b)MEグループの椎体の信号特性は、偽術グループのものと類似しており、埋め込み部位で時間の経過とともに有意な信号変化は観察されません。 (c)NPEグループでは、低信号がT1Wシーケンスではっきりと見え、混合信号と低信号がT2Wシーケンスではっきりと見えます。 12週間から20週間までの期間まで、T2Wシーケンスの低信号を囲む散発的な高信号が減少します。
NPEグループの椎体の着床部位で明らかな骨過形成が見られることがあり、骨過形成はNPEグループと比較して12週間から20週間まで速く発生します(図2C)、モデル化された椎骨で有意な変化は観察されません体; Sham Group and ME Group(図2C)2a、b)。
(a)埋め込まれた部分の椎体の表面は非常に滑らかで、穴はよく癒され、椎体には過形成がありません。 (b)MEグループの移植されたサイトの形状は、偽操作グループのものと似ており、埋め込まれた部位の外観に明らかな変化はありません。 (c)NPEグループの埋め込み部位で骨過形成が発生しました。骨の過形成は急速に増加し、椎間板を介して対側椎体まで伸びました。
組織学的分析は、骨形成に関するより詳細な情報を提供します。図3は、H&Eで染色された術後セクションの写真を示しています。偽術群では、軟骨細胞が適切に配置され、細胞増殖は検出されませんでした(図3A)。 MEグループの状況は、偽術グループの状況に似ていました(図3B)。ただし、NPEグループでは、移植部位で多数の軟骨細胞とNP様細胞の増殖が観察されました(図3C)。
(a)エンドプレートの近くで骨縁を見ることができ、軟骨細胞は均一な細胞のサイズと形状と増殖なし(40倍)できれいに配置されています。 (b)MEグループの移植部位の状態は、偽のグループの条件に似ています。後骨と軟骨細胞を見ることができますが、移植部位に明らかな増殖はありません(40回)。 (b)軟骨細胞とNP様細胞が有意に増殖し、軟骨細胞の形状とサイズが不均一であることがわかります(40倍)。
インターロイキン4(IL-4)mRNA、インターロイキン17(IL-17)mRNA、およびインターフェロンγ(IFN-γ)mRNAの発現がNPEおよびMEグループの両方で観察されました。標的遺伝子の発現レベルを比較すると、IL-4、IL-17、およびIFN-γの遺伝子発現は、MEグループおよび偽操作グループと比較してNPEグループで有意に増加しました(図4) (p <0.05)。偽操作グループと比較して、MEグループのIL-4、IL-17、およびIFN-γの発現レベルはわずかに増加し、統計的変化に達しませんでした(p> 0.05)。
NPEグループにおけるIL-4、IL-17およびIFN-γのmRNA発現は、偽操作グループおよびMEグループのものよりも有意に高い傾向を示しました(P <0.05)。
対照的に、MEグループの発現レベルは有意な差を示さなかった(p> 0.05)。
ウェスタンブロット分析は、IL-4およびIL-17に対する市販の抗体を使用して実施して、mRNA発現パターンの変化を確認しました。図5A、Bに示すように、MEグループおよび偽操作グループと比較して、NPEグループのIL-4およびIL-17のタンパク質レベルが有意に増加しました(P <0.05)。偽操作グループと比較して、MEグループのIL-4およびIL-17のタンパク質レベルも統計的に有意な変化に達することができませんでした(P> 0.05)。
(A)NPEグループのIL-4およびIL-17のタンパク質レベルは、MEグループおよびプラセボ群のタンパク質レベルよりも有意に高かった(P <0.05)。 (b)ウエスタンブロットヒストグラム。
手術中に得られたヒトサンプルの数は限られているため、MCの病因に関する明確で詳細な研究はやや困難です。 MCの動物モデルを確立して、その潜在的な病理学的メカニズムを研究しようとしました。同時に、放射線評価、組織学的評価、および分子生物学的評価を使用して、NP自家移植によって誘導されるMCのコースに従いました。その結果、NP移植モデルは、12週間から20週間の時点(T1W配列の混合低信号とT2W配列の低信号)と組織の変化を示し、組織学的および分子を示す信号強度に徐々に変化しました。生物学的評価により、放射線研究の結果が確認されました。
この実験の結果は、NPEグループの椎体侵害の部位で視覚的および組織学的変化が発生したことを示しています。同時に、IL-4、IL-17、およびIFN-γ遺伝子の発現、ならびにIL-4、IL-17およびIFN-γの発現が観察され、椎骨における自己脊髄組織の侵害が浸透していることを示しています。身体は、一連の信号と形態学的変化を引き起こす可能性があります。動物モデルの椎体の信号特性(T1Wシーケンスの低信号、T2Wシーケンスの混合信号、および低信号)は、ヒト脊椎細胞のものと非常に類似していること、およびMRI特性も簡単に見つけることができます。組織学と肉眼的解剖学の観察結果、つまり椎体細胞の変化は進行性です。急性外傷によって引き起こされる炎症反応は、穿刺後すぐに現れる可能性がありますが、MRIの結果は、MRIの変化の回復や反転の兆候なしに、穿刺後12週間後に徐々に増加する信号変化が現れ、20週間まで持続することを示しました。これらの結果は、自家椎骨NPがウサギに進行性MVを確立するための信頼できる方法であることを示唆しています。
この穿刺モデルには、適切なスキル、時間、および外科的努力が必要です。予備的な実験では、傍脊椎靭帯構造の解剖または過度の刺激により、椎骨骨糞が形成される可能性があります。隣接するディスクに損傷を与えたり、刺激したりしないように注意する必要があります。一貫した再現性のある結果を得るには、貫通の深さを制御する必要があるため、長さ3 mmの針の鞘を切断することで手動でプラグを作成しました。このプラグを使用すると、椎体の均一な掘削深度が保証されます。予備的な実験では、手術に関与する3人の整形外科医が、18ゲージの針やその他の方法よりも16ゲージの針で作業しやすいことがわかりました。掘削中の過度の出血を避けるために、針をしばらく保持すると、より適切な挿入穴が提供され、ある程度のMCをこのように制御できることが示唆されます。
多くの研究ではMCを標的にしていますが、MC25,26,27の病因と病因についてはほとんど知られていません。以前の研究に基づいて、自己免疫がMC12の発生と開発に重要な役割を果たすことがわかりました。この研究では、抗原刺激後のCD4+細胞の主な分化経路であるIL-4、IL-17、およびIFN-γの定量的発現を調べました。私たちの研究では、陰性グループと比較して、NPEグループはIL-4、IL-17、およびIFN-γの発現が高く、IL-4およびIL-17のタンパク質レベルも高かった。
臨床的には、IL-17 mRNA発現は、椎間板ヘルニア患者からNP細胞で増加します28。 IL-4およびIFN-γの発現レベルの増加は、健康なコントロールである29と比較して、急性非圧縮ディスクヘルニアモデルでも見られました29。 IL-17は、炎症、自己免疫疾患の組織損傷に重要な役割を果たし、IFN-γ31に対する免疫応答を強化します。 IL-17を介した組織損傷の強化は、MRL/LPR MICE32および自己免疫感受性MICE33で報告されています33。 IL-4は、炎症性サイトカイン(IL-1βやTNFαなど)およびマクロファージの活性化の発現を阻害できます34。 IL-4のmRNA発現は、同じ時点でIL-17およびIFN-γと比較してNPEグループで異なっていたことが報告されました。 NPEグループにおけるIFN-γのmRNA発現は、他のグループのIFN-γの発現よりも有意に高かった。したがって、IFN-γ産生は、NP挿入によって誘発される炎症反応のメディエーターである可能性があります。研究により、IFN-γは、活性化されたタイプ1ヘルパーT細胞、天然キラー細胞、マクロファージ35,36を含む複数の細胞タイプによって産生され、免疫応答を促進する重要な炎症誘発性サイトカインであることが示されています37。
この研究は、自己免疫反応がMCの発生と発達に関与している可能性があることを示唆しています。 Luoma et al。 MCと顕著なNPの信号特性はMRIで類似していることがわかり、両方ともT2Wシーケンス38で高い信号を示しています。一部のサイトカインは、IL-139などのMCの発生と密接に関連していることが確認されています。 Ma et al。 NPの上向きまたは下向きの突出は、MC12の発生と発達に大きな影響を与える可能性があることを示唆しました。 Bobechko40とHerzbein et al.41は、NPは出生時から血管循環に入ることができない免疫耐性組織であると報告しました。 NPプロトルジョンは、異物を血液供給に導入し、それによって局所的な自己免疫反応を媒介する42。自己免疫反応は、多数の免疫因子を誘導する可能性があり、これらの因子が組織に継続的にさらされると、シグナル伝達の変化を引き起こす可能性があります43。この研究では、IL-4、IL-17、およびIFN-γの過剰発現は典型的な免疫因子であり、NPとMCS44の間の密接な関係をさらに証明しています。この動物モデルは、NPのブレークスルーとエンドプレートへのエントリをよく模倣しています。このプロセスは、MCに対する自己免疫の影響をさらに明らかにしました。
予想通り、この動物モデルは、MCを研究するためのプラットフォームを提供します。ただし、このモデルにはまだいくつかの制限があります。まず、動物の観察段階で、一部の中間段階のウサギは組織学的および分子生物学のテストのために安楽死させる必要があるため、一部の動物は時間の経過とともに「使用できなくなります」。第二に、この研究では3つの時点が設定されていますが、残念ながら、1つのタイプのMC(MODICタイプIの変更)のみをモデル化したため、人間の疾患の発達プロセスを表すだけでは不十分であり、より多くの時点をに設定する必要があります。すべての信号の変更をよりよく観察します。第三に、組織構造の変化は実際に組織学的染色によって明確に示される可能性がありますが、一部の特殊な手法は、このモデルの微細構造の変化をよりよく明らかにすることができます。たとえば、偏光顕微鏡を使用して、ウサギ間椎間板における線維症の形成を分析しました45。 MCおよびエンドプレートに対するNPの長期的な影響には、さらなる研究が必要です。
54個のオスのニュージーランドの白いウサギ(重量約2.5〜3 kg、3〜3.5ヶ月)は、偽手術グループ、筋肉移植グループ(MEグループ)、神経根移植群(NPEグループ)にランダムに分割されました。すべての実験手順は天津病院の倫理委員会によって承認され、実験方法は承認されたガイドラインに厳密に従って実施されました。
S. sobajima 46の外科的技術にいくつかの改善が行われました。各ウサギを横方向のリコンシー位置に配置し、5つの連続した腰椎椎間板(IVD)の前面が後外側後腹膜アプローチを使用して露出しました。各ウサギに全身麻酔を与えられました(耳の静脈を介して20%ウレタン、5 mL/kg)。 rib骨の下端から骨盤の縁までの縦方向の皮膚切開が行われ、2 cmの腹側から傍脊椎の筋肉になりました。 L1からL6への右前外側脊椎は、上にある皮下組織、後腹膜組織、および筋肉の鋭く鈍的解剖により曝露されました(図6A)。ディスクレベルは、L5-L6ディスクレベルの解剖学的ランドマークとして、骨盤BRIMを使用して決定されました。 16ゲージの穿刺針を使用して、L5椎骨の端板近くの穴を3 mmの深さまで掘削します(図6b)。 5 mlシリンジを使用して、L1-L2脊椎椎間板の自己脊髄核を吸引します(図6C)。各グループの要件に従って、脊髄核または筋肉を除去します。ドリルの穴が深くなった後、吸収性のある縫合糸が深い筋膜、表在性筋膜、皮膚に置かれ、手術中に椎体の骨骨組織を損傷しないように注意します。
(a)L5 – L6ディスクは、後外側後腹膜アプローチを介して露出しています。 (b)16ゲージの針を使用して、L5エンドプレートの近くに穴を開けます。 (c)自己MFが収穫されます。
全身麻酔は、耳の静脈を介して20%ウレタン(5 ml/kg)を投与し、肺脊椎のX線写真を術後12、16、および20週間で繰り返しました。
手術後12、16、20週間のケタミン(25.0 mg/kg)および静脈内ペントバルビタール(1.2 g/kg)の筋肉内注射により、ウサギを犠牲にしました。組織学的分析のために脊椎全体を除去し、実際の分析を実施しました。定量的逆転写(RT-QPCR)およびウエスタンブロッティングを使用して、免疫因子の変化を検出しました。
MRI検査は、直交肢コイルレシーバーを装備した3.0 Tの臨床磁石(GE Medical Systems、Florence、SC)を使用してウサギで実施されました。ウサギを耳の静脈を介して20%ウレタン(5 ml/kg)で麻酔し、腰部内に仰pineを置き、腰部領域を直径5インチの円形表面コイル(GE医療システム)を中心にしました。 L3 – L4からL5 – L6に腰椎椎間板の位置を定義するために、冠状T2強調のローカライザー画像(TR、1445ミリ秒、TE、37ミリ秒)を取得しました。矢状面T2強調スライスは、次の設定で取得されました。2200ミリ秒の繰り返し時間(TR)と70ミリ秒のエコー時間(TE)の高速スピンエコーシーケンス、マトリックス。 260および8つの刺激の視野;切断厚は2 mmで、ギャップは0.2 mmでした。
最後の写真が撮影され、最後のウサギが殺された後、偽、筋肉包埋、および組織学的検査のためにNPディスクを除去しました。組織を10%中性緩衝ホルマリンで1週間固定し、エチレンジアミン膜酢酸で脱折り、パラフィンを切片化しました。組織ブロックをパラフィンに埋め込み、ミクロトームを使用して矢状切片(厚さ5μm)にカットしました。切片をヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色しました。
各グループのウサギから椎間板を収集した後、製造業者の指示とREMROM II逆転写システム(Promega. 、米国ウィスコンシン州マディソン)。逆転写が行われました。
RT-QPCRは、製造業者の指示に従って、Prism 7300(Applied Biosystems Inc.、USA)およびSYBR Green Jump Start Taq Readymix(Sigma-Aldrich、St。Louis、MO、USA)を使用して実行されました。 PCR反応容積は20μLで、希釈したcDNA1.5μLと0.2μMの各プライマーが含まれていました。プライマーは、Oligoperfect Designer(Invitrogen、Valencia、CA)によって設計され、Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co.、Ltd。(中国)によって製造されました(表1)。次の熱サイクリング条件が使用されました:94°Cでの初期ポリメラーゼ活性化ステップ2分間、次にテンプレート変性のために94°Cでそれぞれ15秒の40サイクル、60°Cで1分間アニーリング、伸び、および蛍光。測定は、72°Cで1分間行われました。すべてのサンプルを3回増幅し、RT-QPCR分析に平均値を使用しました。増幅データは、FlexStation 3(Molecular Devices、Sunnyvale、CA、USA)を使用して分析されました。 IL-4、IL-17、およびIFN-γ遺伝子発現は、内因性コントロール(ACTB)に対して正規化されました。標的mRNAの相対発現レベルは、2-ΔΔCT法を使用して計算されました。
RIPA溶解緩衝液(プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む)の組織ホモジナイザーを使用して組織から総タンパク質を抽出し、4°Cで20分間13,000 rpmで遠心分離して組織デブリを除去しました。レーンごとに50マイクログラムのタンパク質をロードし、10%SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に移しました。ブロッキングは、室温で0.1%トゥイーン20を含むトリス緩衝生理食塩水(TBS)で5%非脂肪乾燥牛乳で行われました。膜をウサギ抗デコリン原発抗体(希釈1:200; Boster、Wuhan、China)とインキュベートした(希釈1:200; Bioss、Biijing、China)で4°Cで一晩、2日目に反応しました。二次抗体(1:40,000希釈でヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG)を西洋ワサビペルオキシダーゼ(Boster、Wuhan、中国)と組み合わせて室温で1時間。 X線照射後の化学発光膜の化学発光の増加により、ウエスタンブロットシグナルは検出されました。デンシトメトリー分析のために、ブロットをスキャンしてバンドスカンソフトウェアを使用して定量化し、結果をチューブリン免疫反応性に対する標的遺伝子免疫反応性の比として表現しました。
統計計算は、SPSS16.0ソフトウェアパッケージ(SPSS、米国)を使用して実行されました。研究中に収集されたデータは、平均±標準偏差(平均±SD)として表され、一方向反復測定分散分析(ANOVA)を使用して分析され、2つのグループ間の違いを決定しました。 P <0.05は統計的に有意と見なされました。
したがって、自己NPを椎体に埋め込み、マクロ分析観察、MRI分析、組織学的評価、分子生物学的分析を実行することにより、MCの動物モデルの確立は、ヒトMCのメカニズムを評価および理解し、新しい治療法を開発するための重要なツールになる可能性があります。介入。
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投稿時間:Dec-13-2024