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創傷における微生物の増殖は、しばしばバイオフィルムとして現れ、治癒を妨げ、根絶が困難である。新しい銀ドレッシングは創傷感染と戦うと謳っているが、その抗バイオフィルム効果と感染とは無関係の治癒効果は一般的に不明である。黄色ブドウ球菌と緑膿菌のin vitroおよびin vivoバイオフィルムモデルを使用して、Ag1+イオン生成ドレッシング、エチレンジアミン四酢酸と塩化ベンゼトニウムを含むAg1+ドレッシング（Ag1+/EDTA/BC）、および硝酸銀を含むドレッシング（Agオキシ塩）の有効性を報告する。これらは、創傷バイオフィルムとその治癒への影響に対抗するためにAg1+、Ag2+、およびAg3+イオンを生成する。Ag1+ドレッシングは、in vitroおよびマウス（C57BL/6j）における創傷バイオフィルムに対して最小限の効果しか示さなかった。対照的に、酸素化銀塩およびAg1+/EDTA/BCドレッシングは、試験管内でバイオフィルム中の生菌数を著しく減少させ、マウス創傷バイオフィルム中の細菌およびEPS成分の著しい減少を示しました。これらのドレッシングは、バイオフィルム感染創傷と非感染創傷の治癒に異なる影響を与え、酸素化塩ドレッシングは、対照治療および他の銀ドレッシングと比較して、再上皮化、創傷サイズ、および炎症に対してより有益な効果を示しました。銀ドレッシングの異なる物理化学的特性は、創傷バイオフィルムおよび治癒に異なる影響を与える可能性があり、バイオフィルム感染創傷の治療用ドレッシングを選択する際には、この点を考慮する必要があります。
慢性創傷は「正常な治癒段階を秩序正しく適時に経て進まない創傷」と定義されています1。慢性創傷は、患者と医療システムに心理的、社会的、経済的な負担をもたらします。創傷および関連する合併症の治療に対するNHSの年間支出は、2017～2018年には83億ポンドと推定されています2。慢性創傷は現在、米国でも深刻な問題となっており、メディケアは創傷患者の治療にかかる年間費用を281億～968億ドルと推定しています3。
感染は創傷治癒を妨げる主要な要因です。感染はしばしばバイオフィルムとして現れ、治癒しない慢性創傷の78%にバイオフィルムが存在します。バイオフィルムは、微生物が創傷表面などの表面に不可逆的に付着し、凝集して細胞外ポリマー（EPS）産生コミュニティを形成するときに形成されます。創傷バイオフィルムは炎症反応の増加と関連しており、組織損傷を引き起こし、治癒を遅らせたり妨げたりする可能性があります4。組織損傷の増加は、マトリックスメタロプロテアーゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、および活性酸素種の活性増加に起因する可能性があります5。さらに、炎症細胞とバイオフィルム自体が酸素を大量に消費するため、局所的な組織低酸素症を引き起こし、効果的な組織修復に必要な重要な酸素を細胞から奪う可能性があります6。
成熟したバイオフィルムは抗菌剤に対する耐性が非常に高いため、バイオフィルム感染症を制御するには、機械的処置に続いて効果的な抗菌剤を投与するなど、積極的な戦略が必要となる。バイオフィルムは急速に再生する可能性があるため、効果的な抗菌剤を使用することで、外科的デブリードマン後の再形成リスクを低減できる。
銀は抗菌性ドレッシングにますます多く使用されており、慢性感染創傷の第一選択治療としてよく用いられています。市販されている銀ドレッシングは数多くあり、それぞれ銀の組成、濃度、基剤が異なります。銀アームバンドの進歩により、新しい銀アームバンドが開発されました。銀の金属形態（Ag0）は不活性です。抗菌効果を発揮するには、電子を失ってイオン銀（Ag1+）を形成する必要があります。従来の銀ドレッシングには、液体に触れると分解してAg1+イオンを形成する銀化合物または金属銀が含まれています。これらのAg1+イオンは細菌細胞と反応し、生存に必要な構造成分または重要なプロセスから電子を取り除きます。特許技術により、創傷ドレッシングに含まれる新しい銀化合物、Agオキシ塩（硝酸銀、Ag7NO11）が開発されました。従来の銀とは異なり、酸素を含む塩の分解により、より高い価数（Ag1+、Ag2+、Ag3+）の銀状態が生成されます。試験管内研究では、酸素化銀塩の低濃度は、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌などの病原性細菌に対して、単一イオン銀（Ag1+）よりも効果的であることが示されています8,9。別の新しいタイプの銀ドレッシングには、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）と塩化ベンゼトニウム（BC）という追加成分が含まれており、これらはバイオフィルムEPSを標的とし、それによって銀のバイオフィルムへの浸透を増加させると報告されています。これらの新しい銀技術は、創傷バイオフィルムを標的とする新しい方法を提供します。しかし、これらの抗菌剤が創傷環境と感染とは無関係の治癒に及ぼす影響は、好ましくない創傷環境を作り出したり、治癒を遅らせたりしないようにするために重要です。いくつかの銀ドレッシングでは、試験管内での銀の細胞毒性に関する懸念が報告されています10,11。しかし、試験管内での細胞毒性はまだ生体内での毒性にはつながっておらず、いくつかのAg1+ドレッシングは良好な安全性プロファイルを示しています12。
本研究では、新規銀製剤を含むカルボキシメチルセルロース製ドレッシング材の創傷バイオフィルムに対する有効性を、in vitroおよびin vivoで検討した。さらに、感染とは無関係に、これらのドレッシング材が免疫応答および治癒に及ぼす影響についても評価した。
使用したドレッシングはすべて市販品です。3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M、Knutsford、英国) は、抗菌性のない 100% カルボキシメチルセルロース (CMC) ゲルファイバードレッシングで、本研究では対照ドレッシングとして使用しました。3 つの抗菌性 CMC 銀ドレッシングを評価しました。3M Kerracel Ag ドレッシング (3M、Knutsford、英国) は、1.7 wt% の酸化銀塩 (Ag7NO11) を高価数銀イオン (Ag1+、Ag2+、Ag3+) として含有しています。Ag7NO11 の分解中に、Ag1+、Ag2+、Ag3+ イオンが 1:2:4 の比率で生成されます。 1.2%塩化銀（Ag1+）を含むAquacel Ag Extraドレッシング（ConvaTec、英国ディーサイド）13、および1.2%塩化銀（Ag1+）、EDTA、塩化ベンゼトニウムを含むAquacel Ag + Extraドレッシング（ConvaTec、英国ディーサイド）14。
本研究で使用した菌株は、Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781（Public Health England、ソールズベリー）とStaphylococcus aureus NCTC 6571（Public Health England、ソールズベリー）であった。
細菌は、ミュラーヒントンブロス（Oxoid、アルトリンチャム、英国）で一晩培養した。一晩培養した培養液をミュラーヒントンブロスで1:100に希釈し、200 µlを滅菌済みの0.2 µmワットマンシクロポアメンブレン（Whatman plc、メイドストーン、英国）に塗布し、ミュラーヒントン寒天プレート（Sigma-Aldrich Company Ltd、ケント、英国）に載せた。コロニーバイオフィルムは37℃で24時間培養した。これらのコロニーバイオフィルムは対数収縮について試験した。
ドレッシングを 3 cm2 の正方形に切り、滅菌脱イオン水であらかじめ湿らせておく。寒天プレート上のコロニーのバイオフィルムの上に包帯を置く。バイオフィルムを 24 ヘクタールごとに除去し、バイオフィルム内の生菌数 (CFU/ml) を Day-Angle 中和ブロス (Merck-Millipore) で段階希釈 (10−1 ～ 10−7) して定量した。37 °C で 24 時間培養した後、Mueller-Hinton 寒天プレートで標準平板培養を行った。各処理および各時点を 3 回繰り返し、各希釈度で平板培養を繰り返した。
豚バラ皮は、欧州連合の輸出基準に従って屠殺後15分以内に雌のラージホワイト豚から採取した。皮を剃り、アルコールワイプで洗浄した後、-80℃で24時間凍結して皮を不活性化した。解凍後、1cm2の皮片をPBS、0.6%次亜塩素酸ナトリウム、70%エタノールでそれぞれ20分間ずつ3回洗浄した。表皮を除去する前に、滅菌PBSで3回洗浄して残存エタノールを除去した。皮は、厚さ0.45μmのナイロン膜（Merck-Millipore）を上に置き、10%ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.）を添加した3mlのウシ胎児血清（Sigma）を含む3枚の吸収パッド（Merck-Millipore）を入れた6ウェルプレートで培養した。
コロニーバイオフィルムは、バイオフィルム曝露研究で説明したように培養した。バイオフィルムを膜上で72時間培養した後、滅菌接種ループを使用してバイオフィルムを皮膚表面に塗布し、膜を取り除いた。次に、バイオフィルムをブタの真皮上で37℃でさらに24時間培養し、バイオフィルムが成熟してブタの皮膚に付着するようにした。バイオフィルムが成熟して付着した後、滅菌蒸留水であらかじめ湿らせた1.5 cm2のドレッシングを皮膚表面に直接貼り付け、37℃で24時間培養した。生存細菌は、PrestoBlue細胞生存試薬（Invitrogen、Life Technologies、Paisley、英国）を各外植片の頂端面に均一に塗布し、5分間インキュベートして染色することにより可視化した。Leica DFC425デジタルカメラを使用して、Leica MZ8顕微鏡で画像を即座にキャプチャする。ピンク色に着色された領域は、Image Proソフトウェアバージョン10（Media Cybernetics Inc、メリーランド州ロックビル、Image-Pro（mediacy.com））を用いて定量化した。走査型電子顕微鏡観察は、以下に述べる方法で実施した。
一晩培養した細菌をミュラー・ヒントン培地で1:100に希釈した。培養液200μlを滅菌済みの0.2μmワットマンシクロポアメンブレン（Whatman社、英国メイドストーン）に添加し、ミュラー・ヒントン寒天培地に塗布した。バイオフィルムプレートを37℃で72時間培養し、成熟したバイオフィルムを形成させた。
バイオフィルムが3日間成熟した後、3cm²の正方形の包帯をバイオフィルム上に直接置き、37℃で24時間培養した。包帯をバイオフィルム表面から取り除いた後、各バイオフィルムの表面にPrestoBlue細胞生存率試薬（Invitrogen、マサチューセッツ州ウォルサム）1mlを20秒間添加した。表面を乾燥させた後、Nikon D2300デジタルカメラ（Nikon UK Ltd.、英国キングストン）を使用して色の変化を記録した。
ミューラーヒントン寒天培地で一晩培養し、個々のコロニーを10 mlのミューラーヒントンブロスに移し、37℃（100 rpm）の振とう機で培養した。一晩培養後、培養液をミューラーヒントンブロスで1:100に希釈し、300 µlをミューラーヒントン寒天培地上の0.2 µm円形ワットマンシクロポアメンブレン（Whatman International、メイドストーン、英国）にスポットし、37℃で72時間以内に培養した。成熟したバイオフィルムは、以下に説明するように創傷に適用した。
動物を用いたすべての作業は、マンチェスター大学において、動物福祉倫理審査局（P8721BD27）が承認したプロジェクトライセンスの下、2012年改訂ASPAに基づき内務省が発行したガイドラインに従って実施されました。すべての著者は到着ガイドラインを遵守しました。8週齢のC57BL/6jマウス（Envigo、オックスフォードシャー、英国）をすべてのin vivo研究に使用しました。マウスはイソフルラン（Piramal Critical Care Ltd、ウェスト・ドレイトン、英国）で麻酔し、背部を剃毛して洗浄しました。次に、各マウスにStiefel生検パンチ（Schuco International、ハートフォードシャー、英国）を使用して2×6mmの切除創を作製しました。バイオフィルム感染創の場合、上記のように膜上で72時間培養したコロニーバイオフィルムを、損傷直後に滅菌接種ループを使用して創傷の真皮層に塗布し、膜は廃棄します。湿潤創傷環境を維持するため、1平方センチメートルのドレッシング材を滅菌水であらかじめ湿らせておく。ドレッシング材を各創傷に直接貼り付け、3M Tegadermフィルム（3M、ブラクネル、英国）で覆い、縁の周りにMastisol液体接着剤（Eloquest Healthcare、ファーンデール、ミシガン州）を塗布して接着性を高めた。鎮痛剤として、ブプレノルフィン（Animalcare、ヨーク、英国）を0.1 mg/kgの濃度で投与した。スケジュール1の方法を用いて、負傷後3日目にマウスを屠殺し、必要に応じて創傷部位を摘出して半分に切り、保管する。
ヘマトキシリン（ThermoFisher Scientific社製）およびエオシン（ThermoFisher Scientific社製）染色を製造元のプロトコルに従って実施した。創傷面積および再上皮化は、Image Proソフトウェアバージョン10（Media Cybernetics Inc、メリーランド州ロックビル）を用いて定量化した。
組織切片はキシレン（ThermoFisher Scientific、英国ラフバラ）で脱パラフィン処理し、100～50%の段階的エタノールで再水和し、脱イオン水（ThermoFisher Scientific）に短時間浸漬した。免疫組織化学は、製造元のプロトコルに従って、VectaStain Elite ABC PK-6104キット（Vector Laboratories、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）を使用して実施した。好中球に対する一次抗体NIMP-R14（Thermofisher Scientific）およびマクロファージに対する一次抗体Ms CD107b Pure M3/84（BD Biosciences、英国ウォーキンガム）をブロッキング溶液で1:100に希釈し、切断面に添加した後、2つの抗体Anti-、VectaStain ABCおよびVector Nova Red Peroxidase（HRP）基質キット（Vector Laboratories、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）を添加し、ヘマトキシリンで対比染色した。画像は、オリンパスBX43顕微鏡とオリンパスDP73デジタルカメラ（オリンパス、英国サウスエンド・オン・シー）を使用して取得した。
皮膚サンプルは、0.1 M HEPES (pH 7.4) 中の 2.5% グルタルアルデヒドと 4% ホルムアルデヒドで 4℃ で 24 時間固定した。サンプルは段階的エタノールで脱水し、Quorum K850 臨界点乾燥機 (Quorum Technologies Ltd、Loughton、英国) で CO2 乾燥させ、Quorum SC7620 ミニ スパッタラー/グロー放電システムで金-パラジウム合金をスパッタコーティングした。サンプルは、FEI Quanta 250 走査型電子顕微鏡 (ThermoFisher Scientific) を使用して画像化し、創傷の中心点を可視化した。
切除したマウスの創傷表面にToto-1ヨウ化物（2 μM）を塗布し、37℃で5分間インキュベートした後（ThermoFisher Scientific社製）、Syto-60（10 μM）を37℃で処理した（ThermoFisher Scientific社製）。Leica TCS SP8を用いて15分間のZスタック画像を作成した。
生物学的および技術的な複製データは、GraphPad Prism V9ソフトウェア（GraphPad Software、カリフォルニア州ラホヤ）を用いて表にまとめ、解析した。各処理と非抗菌性対照ドレッシングとの間の差を検定するために、ダネットの事後検定を用いた多重比較による一元配置分散分析を行った。p値が0.05未満の場合を有意差ありとした。
銀ゲル繊維ドレッシングの有効性は、まず試験管内で黄色ブドウ球菌と緑膿菌のバイオフィルムコロニーに対して評価された。銀ドレッシングには、銀の異なる配合が含まれている。従来の銀ドレッシングはAg1+イオンを生成する。EDTA/BCの添加後にAg1+イオンを生成できる銀ドレッシングは、バイオフィルムマトリックスを破壊し、銀の抗菌作用の下で細菌を銀に曝露することができる。イオン15、およびAg1+、Ag2+、Ag3+イオンを生成する酸素化Ag塩を含むドレッシング。その有効性は、ゲル状繊維から作られた非抗菌性対照ドレッシングと比較された。バイオフィルム内の残存生存細菌は、8日間24時間ごとに評価された（図1）。5日目に、バイオフィルムの回復を評価するために、バイオフィルムに3.85×105個の黄色ブドウ球菌または1.22×105個の緑膿菌を再接種した。抗菌剤を含まない対照ドレッシングと比較して、Ag1+ドレッシングは5日間にわたって黄色ブドウ球菌および緑膿菌のバイオフィルム中の細菌生存率にほとんど影響を与えなかった。対照的に、酸素化銀およびAg1+ + EDTA/BC塩を含むドレッシングは、5日以内にバイオフィルム内の細菌を殺菌するのに効果的であった。5日目に浮遊細菌を繰り返し接種した後、バイオフィルムの回復は観察されなかった（図1）。
銀ドレッシング処理後の黄色ブドウ球菌および緑膿菌バイオフィルム中の生菌数の定量。黄色ブドウ球菌および緑膿菌のバイオフィルムコロニーを銀ドレッシングまたは非抗菌性対照ドレッシングで処理し、残存する生菌数を24時間ごとに測定した。5日後、バイオフィルムに3.85×10⁵個の黄色ブドウ球菌または1.22×10⁵個の緑膿菌コロニーを再接種し、バイオフィルムの回復を評価するために、細菌プランクトンである緑膿菌のコロニーを個別に形成した。グラフは平均値±標準誤差を示す。
銀ドレッシングがバイオフィルムの生存率に及ぼす影響を可視化するために、ブタの皮膚上で体外で培養した成熟バイオフィルムにドレッシングを適用した。24 時間後、ドレッシングを除去し、バイオフィルムを青色の反応性色素で染色した。この色素は生きた細菌によって代謝され、ピンク色になる。コントロールドレッシングで処理したバイオフィルムはピンク色で、バイオフィルム内に生存可能な細菌が存在することを示している（図 2A）。対照的に、Ag オキシソルドレッシングで処理したバイオフィルムは主に青色で、ブタの皮膚表面に残っている細菌は生存不可能な細菌であることを示している（図 2B）。Ag1+ 含有ドレッシングで処理したバイオフィルムでは、青色とピンク色が混在しており、バイオフィルム内に生存可能な細菌と生存不可能な細菌が存在することを示している（図 2C）。一方、Ag1+ 含有 EDTA/BC ドレッシングは主に青色で、ピンク色の斑点がいくつか見られ、銀ドレッシングの影響を受けていない領域を示している（図 2D）。活性領域（ピンク）と不活性領域（青）の定量化により、コントロールパッチの活性が75%であることが示された（図2E）。Ag1+ + EDTA/BCドレッシングは、酸素化Ag塩ドレッシングと同様の効果を示し、生存率はそれぞれ13%と14%であった。Ag1+ドレッシングは細菌の生存率も21%低下させた。これらのバイオフィルムは、走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて観察された。コントロールドレッシングとAg1+ドレッシングで処理した後、豚の皮膚を覆う緑膿菌の層が観察された（図2F、H）が、Ag1+ドレッシングで処理した後は、細菌細胞はほとんど見られず、その下に細菌細胞がほとんど見られなかった。コラーゲン線維は、豚の皮膚の組織構造とみなすことができる（図2G）。Ag1+ + EDTA/BCドレッシングで処理した後、細菌プラークと下層のコラーゲン線維プラークが見られた（図2I）。
銀ドレッシング処理後の緑膿菌バイオフィルムの可視化。(A～D) 豚の皮膚上で増殖した緑膿菌バイオフィルムの細菌生存率を、銀ドレッシングまたは非抗菌性対照ドレッシングで処理してから24時間後にPrestoBlue生存率染色液を用いて可視化した。生菌はピンク色、非生存菌と豚の皮膚は青色。(E) 走査型電子顕微鏡Image Proバージョン10(FI)を用いて豚の皮膚(ピンク色の斑点)上で増殖した緑膿菌バイオフィルムを定量し、銀ドレッシングまたは非抗菌性対照ドレッシングで24時間処理した。SEMスケールバー = 5 µm。(J～M) フィルター上で増殖したコロニー状バイオフィルムを、銀ドレッシングで24時間培養した後、PrestoBlue反応性染色液で染色した。
ドレッシングとバイオフィルムの密接な接触がドレッシングの効果に影響を与えるかどうかを判断するために、平らな表面に置かれたコロニー状のバイオフィルムをドレッシングで24時間処理し、その後反応性染料で染色した。未処理のバイオフィルムは濃いピンク色であった（図2J）。酸素化銀塩を含むドレッシングで処理したバイオフィルムとは対照的に（図2K）、Ag1+またはAg1+ + EDTA/BCを含むドレッシングで処理したバイオフィルムはピンク色の染色帯を示した（図2L、M）。このピンク色は生存可能な細菌の存在を示しており、ドレッシング内の縫合部分と関連している。これらの縫い付けられた部分は、バイオフィルム内の細菌が生存できるデッドスペースを作り出す。
銀ドレッシングの生体内での有効性を評価するため、成熟した黄色ブドウ球菌および緑膿菌バイオフィルムに感染したマウスの全層切除創を、抗菌剤を含まない対照ドレッシングまたは銀ドレッシングで治療した。3日間の治療後、肉眼画像解析により、酸素化塩ドレッシングで治療した場合、抗菌剤を含まない対照ドレッシングや他の銀ドレッシングで治療した場合と比較して創傷サイズが小さいことが示された（図3A-H）。これらの観察結果を確認するため、創傷を採取し、Image Proソフトウェアバージョン10を使用して、ヘマトキシリンおよびエオシン染色した組織切片上で創傷面積と再上皮化を定量化した（図3I-L）。
銀ドレッシングがバイオフィルム感染創の表面および再上皮化に及ぼす影響。（A～H）抗菌剤不使用の対照ドレッシング、酸素化銀塩ドレッシング、Ag1+ドレッシング、およびAg1+ドレッシングで3日間治療した後の、緑膿菌（A～D）および黄色ブドウ球菌（E～H）のバイオフィルムに感染した小細胞。代表的な肉眼画像。Ag1+ + EDTA/BCドレッシングを貼ったマウスの創傷。（IL）緑膿菌感染の代表例、創傷面積と上皮再生を定量化するために使用したヘマトキシリンおよびエオシン染色組織切片。緑膿菌（M、N）および黄色ブドウ球菌（O、P）バイオフィルムに感染した創傷の創傷面積（M、O）および再上皮化率（N、P）の定量化（各治療群n = 12）。グラフは平均値±標準誤差を示す。*はp = < 0.05、**はp = < 0.01を意味する。肉眼的スケール = 2.5 mm、組織学的スケール = 500 µm。
Pseudomonas aeruginosaバイオフィルムに感染した創傷の創傷面積の定量化（図3M）では、Agオキシ塩で治療した創傷の平均創傷サイズは2.5 mm2であったのに対し、非抗菌性対照ドレッシングの平均創傷サイズは3.1 mm2であったが、これは真実ではない。統計的に有意な差が認められた（図3M）。p = 0.423）。Ag1+またはAg1+ + EDTA/BCで治療した創傷では、創傷面積の減少は認められなかった（それぞれ3.1 mm2および3.6 mm2）。酸素化Ag塩ドレッシングによる治療は、非抗菌性対照ドレッシング（それぞれ34%および15%、p = 0.029）およびAg1+またはAg1+ + EDTA/BC（それぞれ10%および11%）よりも再上皮化を促進した（図3N）。
黄色ブドウ球菌バイオフィルムに感染した創傷でも、創傷面積と上皮再生に関して同様の傾向が観察された（図3O）。酸素化銀塩を含むドレッシングは、対照の非抗菌性ドレッシング（2.6 mm2）と比較して創傷面積（2.0 mm2）を23%減少させたが、この減少は有意ではなかった（p = 0.304）（図3O）。さらに、Ag1+治療群の創傷面積はわずかに減少した（2.4 mm2）が、Ag1+ + EDTA/BCドレッシングで治療した創傷では創傷面積は減少しなかった（2.9 mm2）。銀の酸素塩は、非抗菌性対照ドレッシングで治療した創傷（12%、p = 0.003）よりも、黄色ブドウ球菌バイオフィルムに感染した創傷の再上皮化（31%）をより促進した（図3P）。 Ag1+ドレッシング（16%、p = 0.903）とAg+1 + EDTA/BCドレッシング（14%、p = 0.965）は、対照群と同様の上皮再生レベルを示した。
銀ドレッシングがバイオフィルムマトリックスに及ぼす影響を可視化するために、Toto 1およびSyto 60ヨウ化物染色を行った（図4）。Toto 1ヨウ化物は細胞不透過性色素であり、バイオフィルムのEPSに豊富に含まれる細胞外核酸を正確に可視化するために使用できる。Syto 60は対比染色として使用される細胞透過性色素である16。緑膿菌（図4A-D）および黄色ブドウ球菌（図4I-L）のバイオフィルムを接種した創傷におけるToto 1およびSyto 60ヨウ化物の観察では、ドレッシング処理3日後にバイオフィルム中のEPSが有意に減少したことが示された。酸素化塩AgおよびAg1+ + EDTA/BCを含む。追加の抗バイオフィルム成分を含まないAg1+ドレッシングは、緑膿菌を接種した創傷における無細胞DNAを大幅に減少させたが、黄色ブドウ球菌を接種した創傷では効果が低かった。
対照または銀ドレッシングで3日間治療した後の創傷バイオフィルムの生体内イメージング。細胞外バイオフィルムポリマーの成分である細胞外核酸を可視化するためにToto 1（緑色）で染色した緑膿菌（A～D）および黄色ブドウ球菌（I～L）の共焦点画像。細胞内核酸を染色するには、Syto 60（赤色）を使用する。P. 対照および銀ドレッシングで3日間治療した後の緑膿菌（E～H）および黄色ブドウ球菌（M～P）バイオフィルムに感染した創傷の走査型電子顕微鏡像。SEMスケールバー = 5 µm。共焦点イメージングスケールバー = 50 µm。
走査型電子顕微鏡観察により、緑膿菌（図4E-H）および黄色ブドウ球菌（図4M-P）のバイオフィルムコロニーを接種したマウスでは、すべての銀含有ドレッシングで3日間治療した後、創傷内の細菌数が有意に減少したことが示された。
バイオフィルム感染マウスの創傷炎症に対する銀ドレッシングの効果を評価するため、対照または銀ドレッシングで3日間治療したバイオフィルム感染創傷の切片を、好中球およびマクロファージに特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に染色した。好中球およびマクロファージの定量的測定は肉芽組織内で行った。図5）。すべての銀ドレッシングは、3日間の治療後、非抗菌性対照ドレッシングと比較して、緑膿菌感染創傷の好中球およびマクロファージの数を減少させた。しかし、酸素化銀塩ドレッシングによる治療は、試験した他の銀ドレッシングと比較して、好中球（p = <0.0001）およびマクロファージ（p = <0.0001）のより大きな減少をもたらした（図5I、J）。 Ag1+ + EDTA/BC は創傷バイオフィルムに対してより大きな効果を示したが、好中球およびマクロファージのレベルを Ag1+ ドレッシングよりも小さく減少させた。S. aureus バイオフィルムに感染した中等度の創傷は、コントロールと比較して Ag (p = <0.0001)、Ag1+ (p = 0.0008) および Ag1++ EDTA/BC (p = 0.0043) オキシソルでドレッシングした後も観察された。好中球減少症についても同様の傾向が観察された。包帯 (図 5K)。しかし、S. aureus バイオフィルムに感染した創傷では、コントロールと比較して肉芽組織中のマクロファージの数が有意に減少したのは酸素化 Ag 塩ドレッシングのみであった (p = 0.0339) (図 5L)。
非抗菌性対照または銀ドレッシングで 3 日間治療した後、緑膿菌および黄色ブドウ球菌バイオフィルムに感染した創傷で好中球とマクロファージを定量した。好中球 (AD) およびマクロファージ (EH) は、好中球またはマクロファージに特異的な抗体で染色した組織切片で定量した。緑膿菌 (I および J) および黄色ブドウ球菌 (K および L) バイオフィルムに感染した創傷における好中球 (I および K) およびマクロファージ (J および L) の定量。各グループの N = 12。グラフは平均 +/- 標準誤差、非抗菌性対照ドレッシングと比較した有意値を示し、* は p = < 0.05、** は p = < 0.01、*** は p = < 0.001 を意味する。 p値はp<0.0001であることを示す。
次に、銀ドレッシングが感染とは無関係な治癒に及ぼす影響を評価した。感染していない切除創を、抗菌剤を含まない対照ドレッシングまたは銀ドレッシングで3日間治療した（図6）。試験した銀ドレッシングのうち、肉眼画像では、酸素化塩ドレッシングで治療した創傷のみが対照で治療した創傷よりも小さく見えた（図6A-D）。組織学的分析による創傷面積の定量化では、Agオキシソルドレッシングで治療した後の平均創傷面積は2.35 mm2であったのに対し、対照群で治療した創傷では2.96 mm2であったが、この差は統計的に有意ではなかった（p = 0.488）（図6I）。対照的に、Ag1+（3.38 mm2、p = 0.757）またはAg1+ + EDTA/BC（4.18 mm2、p = 0.054）ドレッシングで治療した後は、対照群と比較して創傷面積の減少は観察されなかった。 Agオキシソルドレッシングでは、対照群と比較して上皮再生の増加が観察された（それぞれ30％対22％）が、これは有意水準には達しなかった（p = 0.067）ものの、これはかなり有意であり、以前の結果を裏付けている。オキシソルを含むドレッシングは再上皮化を促進する。-非感染創傷の上皮化17。対照的に、Ag1+またはAg1+ + EDTA/BCドレッシングによる治療は、対照と比較して効果がなく、再上皮化が減少した。
銀製創傷被覆材が、完全切除した非感染マウスの創傷治癒に及ぼす影響。（AD）非抗菌性対照被覆材および銀製被覆材で3日間治療した後の創傷の代表的な肉眼画像。（EH）ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した創傷の代表的な切片。創傷面積（I）および再上皮化率（J）の定量化は、画像解析ソフトウェアを使用して創傷の中央の組織切片から計算した（各治療群につきn = 11～12）。グラフは平均値±標準誤差を示す。*はp = <0.05を意味する。
銀は創傷治癒における抗菌療法として長い歴史を持つが、製剤や投与方法の違いにより抗菌効果に差が生じる可能性がある18。さらに、特定の銀投与システムの抗バイオフィルム特性は完全には解明されていない。宿主の免疫応答は浮遊細菌に対しては比較的効果的であるが、バイオフィルムに対しては一般的に効果が低い19。浮遊細菌はマクロファージによって容易に貪食されるが、バイオフィルム内では凝集した細胞が、免疫細胞がアポトーシスを起こして炎症誘発因子を放出し免疫応答を増強できる程度に宿主応答を制限することによって、さらなる問題を引き起こす20。一部の白血球はバイオフィルムに侵入できることが観察されている21が、この防御が損なわれると細菌を貪食できなくなる22。創傷バイオフィルム感染に対する宿主免疫応答をサポートするために、総合的なアプローチを用いるべきである。創傷デブリードマンはバイオフィルムを物理的に破壊し、バイオバーデンの大部分を除去することができますが、宿主の免疫応答は、特に宿主の免疫応答が損なわれている場合、残存するバイオフィルムに対して効果がない可能性があります。したがって、銀ドレッシングなどの抗菌療法は、宿主の免疫応答をサポートし、バイオフィルム感染を排除することができます。銀の抗菌効果は、組成、濃度、溶解性、および送達基質によって影響を受ける可能性があります。近年、銀加工技術の進歩により、これらのドレッシングはより効果的になっています9,23。銀ドレッシング技術が進歩するにつれて、創傷感染の制御におけるこれらのドレッシングの有効性、そしてより重要なことに、これらの強力な形態の銀が創傷環境と治癒に及ぼす影響を理解することが重要です。
本研究では、2種類の先進的な銀含有ドレッシング材と、バイオフィルムに対してAg1+イオンを生成する従来の銀含有ドレッシング材の有効性を、様々なin vitroおよびin vivoモデルを用いて比較した。また、これらのドレッシング材が創傷環境および感染とは無関係な治癒に及ぼす影響も評価した。送達マトリックスの影響を最小限に抑えるため、試験したすべての銀含有ドレッシング材はカルボキシメチルセルロースで構成されている。
これらの銀ドレッシングの緑膿菌および黄色ブドウ球菌のコロニーバイオフィルムに対する予備評価では、従来のAg1+ドレッシングとは異なり、2つの先進的な銀ドレッシング、Ag1+ + EDTA/BCおよび酸素化銀塩は、数日以内にバイオフィルム細菌を効果的に殺すのに効果的であることが示されました。さらに、これらのドレッシングは、浮遊細菌に繰り返し曝露されてもバイオフィルムの再形成を防ぎます。Ag1+ドレッシングは、Ag1+ + EDTA/BCと同じ銀化合物およびベースマトリックスである塩化銀を含み、同じ期間にわたってバイオフィルム内の細菌の生存率に対する影響は限定的でした。Ag1+ + EDTA/BCドレッシングが、同じマトリックスと銀化合物からなるAg1+ドレッシングよりもバイオフィルムに対して効果的であるという観察は、他の場所で報告されているように、塩化銀のバイオフィルムに対する効果を高めるには追加の成分が必要であるという考えを裏付けています15。これらの結果は、BCとEDTAがドレッシング全体の有効性に寄与する追加的な役割を果たしており、Ag1+ドレッシングにこの成分が含まれていないことが、in vitroでの有効性の実証に失敗した一因となった可能性があるという考えを裏付けています。酸素化Ag塩ドレッシングはAg2+イオンとAg3+イオンを生成し、Ag1+よりも強力な抗菌効果を示し、Ag1+ + EDTA/BCと同程度のレベルであることがわかりました。しかし、高い酸化還元電位のため、Ag3+イオンがどのくらいの期間活性を維持し、創傷バイオフィルムに対して有効であるかは不明であり、さらなる研究が必要です。さらに、本研究ではテストされていないAg1+イオンを生成するさまざまなドレッシングがあります。これらのドレッシングは、さまざまな銀化合物、濃度、およびベースマトリックスで構成されており、Ag1+イオンの送達とバイオフィルムに対する有効性に影響を与える可能性があります。また、創傷ドレッシングのバイオフィルムに対する有効性を評価するために使用されるさまざまなin vitroおよびin vivoモデルがあることにも注目する価値があります。使用するモデルの種類、およびこれらのモデルで使用される培地の塩分とタンパク質含有量は、ドレッシングの効果に影響を与えます。私たちのin vivoモデルでは、バイオフィルムをin vitroで成熟させた後、創傷の皮膚表面に移植しました。宿主マウスの免疫応答は、創傷に塗布された浮遊細菌に対して比較的効果的であり、創傷治癒に伴ってバイオフィルムを形成します。創傷に成熟したバイオフィルムを加えることで、治癒が始まる前に成熟したバイオフィルムが創傷内に定着できるため、バイオフィルム形成に対する宿主免疫応答の効果が制限されます。したがって、私たちのモデルでは、創傷治癒が始まる前に、成熟したバイオフィルムに対する抗菌ドレッシングの効果を評価することができます。
また、銀ドレッシングのフィット感が、試験管内で培養したバイオフィルムおよびブタの皮膚に対する銀ドレッシングの効果に影響を与えることもわかりました。創傷との密着は、ドレッシングの抗菌効果にとって重要であると考えられています24,25。酸素化銀塩を含むドレッシングは成熟したバイオフィルムと密着し、24時間後にバイオフィルム内の生菌数を大幅に減少させました。対照的に、Ag1+およびAg1+ + EDTA/BCドレッシングで処理した場合、かなりの数の生菌が残りました。これらのドレッシングには、ドレッシングの全長に沿って縫合糸が含まれており、バイオフィルムとの密着を妨げるデッドスペースを作り出します。試験管内研究では、これらの非接触領域がバイオフィルム内の生菌の殺菌を妨げました。細菌の生存率は、処理後24時間後にのみ評価しました。時間の経過とともに、ドレッシングがより飽和すると、デッドスペースが減少し、これらの生菌の領域が減少する可能性があります。しかし、これはドレッシング材に含まれる銀の種類だけでなく、ドレッシング材の構成そのものの重要性を浮き彫りにしている。
異なる銀技術の有効性を比較するには、試験管内研究が有用ですが、生体内におけるこれらのドレッシングのバイオフィルムへの影響を理解することも重要です。生体内では、宿主組織と免疫応答が、バイオフィルムに対するドレッシングの有効性に寄与します。これらのドレッシングの創傷バイオフィルムへの影響は、走査型電子顕微鏡と、細胞内および細胞外DNA色素を用いたバイオフィルムのEPS染色によって観察されました。3日間の治療後、すべてのドレッシングがバイオフィルム感染創傷中の無細胞DNAの減少に有効であることがわかりましたが、Ag1+ドレッシングは黄色ブドウ球菌感染創傷に対しては効果が劣っていました。走査型電子顕微鏡では、銀ドレッシングで治療した創傷では細菌が有意に少ないことも示されましたが、これはAg1+ドレッシングと比較して、酸素化Ag塩ドレッシングとAg1+ + EDTA/BCドレッシングでより顕著でした。これらのデータは、試験した銀含有ドレッシングがバイオフィルム構造に様々な程度の影響を与えたことを示していますが、どの銀含有ドレッシングもバイオフィルムを完全に除去することはできませんでした。これは、創傷バイオフィルム感染症の治療には包括的なアプローチが必要であることを裏付けています。銀製アームバンドの使用。治療に先立ち、バイオフィルムの大部分を除去するために物理的なデブリードマンが行われます。
慢性創傷はしばしば重度の炎症状態にあり、過剰な炎症細胞が長期間創傷組織内に留まり、組織損傷を引き起こし、創傷における効率的な細胞代謝と機能に必要な酸素を枯渇させます26。バイオフィルムは、細胞増殖と遊走の阻害、炎症性サイトカインの活性化など、さまざまな方法で治癒に悪影響を与えることにより、この敵対的な創傷環境を悪化させます27。銀含有ドレッシングがより効果的になるにつれて、創傷環境と治癒への影響を理解することが重要になります。
興味深いことに、すべての銀ドレッシングはバイオフィルムの構成に影響を与えましたが、酸素化銀塩ドレッシングのみがこれらの感染創の再上皮化を促進しました。これらのデータは、酸素化銀塩の安全性と毒性プロファイルが良好であることを示した我々の以前の研究17およびKalanら（2017）28の研究結果を裏付けており、低濃度の銀がバイオフィルムに対して効果的でした。
今回の研究では、抗菌銀ドレッシング間の銀技術の違いと、この技術が創傷環境および感染とは無関係の治癒に及ぼす影響を明らかにしました。しかし、これらの結果は、Ag1+ + EDTA/BCドレッシングがウサギの耳の損傷の治癒パラメータをin vivoで改善したことを示す以前の研究とは異なります。ただし、これは動物モデル、測定時間、および細菌適用方法の違いによる可能性があります29。この場合、ドレッシングの有効成分がより長い期間バイオフィルムに作用できるように、損傷後12日目に創傷測定を行いました。これは、Ag1+ + EDTA/BCで治療した臨床的に感染した脚の潰瘍が、治療開始1週間後に最初にサイズが大きくなり、その後、Ag1+ + EDTA/BCによる次の3週間の治療と、非抗菌薬の使用後4週間以内にサイズが小さくなったことを示した研究によって裏付けられています。CMCドレッシングは潰瘍のサイズを小さくします30。
銀の特定の形態と濃度は、これまでin vitroで細胞毒性を示すことが示されてきたが11、これらのin vitroの結果は必ずしもin vivoでの有害作用に結びつくわけではない。さらに、銀技術の進歩と、ドレッシング中の銀化合物と濃度に関する理解の深化により、多くの安全で効果的な銀ドレッシングが開発されてきた。しかし、銀ドレッシング技術が進歩するにつれて、これらのドレッシングが創傷環境に及ぼす影響を理解することが重要である31,32,33。再上皮化率の増加は、炎症促進性M1表現型と比較して抗炎症性M2マクロファージの割合の増加に対応することが以前に報告されている。これは、銀ハイドロゲル創傷ドレッシングをスルファジアジン銀および非抗菌性ハイドロゲルと比較した以前のマウスモデルで観察された34。
慢性創傷では過剰な炎症が見られることがあり、好中球の過剰存在は創傷治癒に悪影響を及ぼすことが観察されている35。好中球を除去したマウスを用いた研究では、好中球の存在が再上皮化を遅らせた。好中球の過剰存在は、慢性創傷や治癒の遅い創傷に関連するスーパーオキシドや過酸化水素などのプロテアーゼや活性酸素種の高レベル化につながる37,38。同様に、マクロファージ数の増加が制御されない場合、創傷治癒の遅延につながる可能性がある39。この増加は、マクロファージが炎症促進表現型から治癒促進表現型に移行できない場合に特に重要であり、その結果、創傷は治癒の炎症期を抜け出せない40。銀含有ドレッシングを3日間使用した後、バイオフィルム感染創傷における好中球とマクロファージの減少が観察されたが、酸素含有塩ドレッシングでは減少がより顕著であった。この減少は、銀に対する免疫応答の直接的な結果、バイオバーデンの減少に対する反応、または創傷が治癒の後期段階にあり、創傷内の免疫細胞が減少していることによるものと考えられる。創傷内の炎症細胞数を減らすことで、創傷治癒に適した環境を維持できる可能性がある。銀オキシ塩が感染とは無関係な治癒を促進する作用機序は不明であるが、銀オキシ塩が酸素を生成し、炎症のメディエーターである有害なレベルの過酸化水素を破壊する能力がこれを説明する可能性があり、さらなる研究が必要である17。
慢性的に治癒しない感染創は、医師と患者双方にとって問題となっています。多くの創傷被覆材は抗菌効果を謳っていますが、創傷の微小環境に影響を与える他の重要な要因に焦点を当てた研究はほとんどありません。本研究では、異なる銀技術がそれぞれ異なる抗菌効果を持ち、さらに重要なことに、感染の有無に関わらず、創傷環境と治癒に異なる影響を与えることを明らかにしました。これらのin vitroおよびin vivo研究では、創傷感染の治療と治癒促進におけるこれらの被覆材の有効性が示されていますが、臨床現場におけるこれらの被覆材の有効性を評価するには、ランダム化比較試験が必要です。
本研究で使用および／または分析されたデータセットは、合理的な要請があれば、責任著者から入手可能です。
投稿日時：2024年7月15日