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創傷の微生物の成長は、しばしばそれ自体がバイオフィルムとして現れ、それは治癒を妨害し、根絶することが困難です。新しい銀のドレッシングは、創傷感染症と戦うことを主張していますが、それらの抗生物質の有効性と感染に依存しない治癒効果は一般に不明です。 in vitroおよびin vivoバイオフィルム黄色ブドウ球菌および緑膿菌のモデルを使用して、Ag1+イオン生成ドレッシングの有効性を報告します。エチレンジアミン膜酢酸と塩化ベンゼトニウム（AG1+/EDTA/BC）を含むAG1+ドレッシング、および硝酸銀（AGオキシソルト）を含むドレッシング。 、Ag1+、Ag2+、およびAg3+イオンを生成して、傷のバイオフィルムと治癒への影響と戦います。 AG1+ドレッシングは、in vitroおよびマウスでの創傷バイオフィルムに最小限の影響を与えました（C57BL/6J）。対照的に、酸素化Ag塩とAg1+/EDTA/BCドレッシングは、in vitroでバイオフィルムの生存性細菌の数を大幅に減少させ、マウス創傷バイオフィルムの細菌およびEPS成分の有意な減少を示しました。これらのドレッシングは、バイオフィルム感染および非バイオフィルムに感染した創傷の治癒に異なる影響を及ぼし、酸素化された塩のドレッシングは、コントロール治療やその他の銀のドレッシングと比較して、再上皮化、創傷サイズ、および炎症により有益な効果をもたらしました。銀のドレッシングの異なる物理化学的特性は、創傷バイオフィルムと治癒に異なる影響を与える可能性があります。これは、バイオフィルムに感染した創傷の治療のためのドレッシングを選択するときに考慮する必要があります。
慢性創傷は、「秩序あるタイムリーな方法で治癒の正常な段階を進行できない傷」として定義されます1。慢性創傷は、患者と医療システムに心理的、社会的、経済的負担をもたらします。傷と関連する併存疾患の治療への年間支出は、2017年から182年にかけて83億ポンドと推定されています。慢性創傷も現在、米国では差し迫った問題であり、メディケアは創傷の患者を28.1〜968億ドルで治療する年間コストを推定しています。
感染は、創傷治癒を防ぐ主要な要因です。感染症は、しばしばバイオフィルムとして現れます。これは、非治癒慢性創傷の78％に存在します。バイオフィルムは、微生物が創傷表面などの表面に不可逆的に付着し、凝集して細胞外ポリマー（EPS）生産コミュニティを形成することができます。創傷バイオフィルムは、組織の損傷につながる炎症反応の増加に関連しており、治癒を遅らせたり防止したりする可能性があります4。組織損傷の増加は、一部には、マトリックスメタロプロテイナーゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、反応性酸素種の活性が増加した可能性があります5。さらに、炎症性細胞とバイオフィルムはそれ自体が酸素の消費者であるため、局所組織低酸素症を引き起こす可能性があります。
成熟したバイオフィルムは、抗菌剤に非常に耐性があり、機械的治療とそれに続く効果的な抗菌治療などのバイオフィルム感染を制御するための積極的な戦略を必要とします。バイオフィルムは迅速に再生できるため、効果的な抗菌薬は、外科的発現後の再蓄積のリスクを減らすことができます7。
銀は、抗菌薬の包帯でますます使用されており、慢性感染した創傷の第一選択治療としてよく使用されます。それぞれが異なる銀組成、濃度、およびベースマトリックスを含む多くの市販の銀のドレッシングがあります。シルバーアームバンドの進歩により、新しいシルバーアームバンドが発生しました。銀の金属型（AG0）は不活性です。抗菌性の有効性を実現するには、電子を失い、イオン銀（Ag1+）を形成する必要があります。従来の銀のドレッシングには、液体化合物または金属銀が含まれており、液体にさらされると、Ag1+イオンを形成するために分解します。これらのAg1+イオンは細菌細胞と反応し、生存に必要な構造成分または重要なプロセスから電子を除去します。特許技術は、創傷ドレッシングに含まれる新しい銀色の化合物であるAg oxySalts（硝酸銀、Ag7NO11）の開発につながりました。従来の銀とは異なり、酸素を含む塩の分解は、より高い価がある銀の状態（Ag1+、Ag2+、およびAg3+）を生成します。 in vitroの研究では、低濃度の酸素化された銀塩は、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌8,9などの病原性細菌に対する単一イオン銀（Ag1+）よりも効果的であることが示されています。別の新しいタイプの銀ドレッシングには、追加の成分、すなわちエチレンジアミン膜酢酸（EDTA）と塩化ベンゼトニウム（BC）が含まれています。これらの新しいシルバーテクノロジーは、創傷バイオフィルムをターゲットにする新しい方法を提供します。しかし、これらの抗菌薬が創傷環境と感染に依存しない治癒に与える影響は、それらが不利な創傷環境を作り出したり、治癒を遅らせたりしないようにするために重要です。 in vitro銀細胞毒性に関する懸念は、いくつかの銀のドレッシング10,11で報告されています。しかし、in vitroの細胞毒性はまだin vivo毒性に変換されておらず、いくつかのAG1+ドレッシングが優れた安全性プロファイルを実証しています12。
ここでは、in vitroおよびin vivoでの創傷バイオフィルムに対する新規銀製剤を含むカルボキシメチルセルロースドレッシングの有効性を調査しました。さらに、これらのドレッシングが免疫応答に及ぼす影響と感染とは無関係に癒しを評価しました。
使用されたすべてのドレッシングは市販されていました。 3Mケラセルジェル繊維ドレッシング（3M、Knutsford、UK）は、この研究でコントロールドレッシングとして使用された非抗菌100％カルボキシメチルセルロース（CMC）ゲル繊維ドレッシングです。 3つの抗菌薬CMC銀ドレッシングが評価されました。つまり、1.7重量％を含む3M Kerracel AGドレッシング（3M、Knutsford、UK）が評価されました。高価数銀イオン（Ag1+、Ag2+およびAg3+）の酸素化銀塩（Ag7NO11）。 Ag7NO11の分解中、Ag1+、Ag2+、およびAg3+イオンは1：2：4の比で形成されます。 1.2％塩化銀（AG1+）（Convatec、Deeside、UK）13およびAquacel Ag+1.2％塩化銀（Ag1+）、EDTAおよびBenzethonium（Convatec、Deeside、UK）を含むAquacel AG+エクストラドレッシングを含むAquacel AGエクストラドレッシング14。
この研究で使用された株は、緑膿菌NCTC 10781（公衆衛生イングランド、ソールズベリー）および黄色ブドウ球菌NCTC 6571（公衆衛生イングランド、ソールズベリー）でした。
バクテリアは、ミュラー・ヒントン・スープ（オキソイド、アルトリンチャム、英国）で一晩栽培されました。その後、一晩の培養をミューラーヒントンスープで1：100、200 µlを滅菌0.2 µmにメッキし、whatman plc、Maidstone、UK）にMueller-Hinton Agar Plates（Sigma-Aldrich Company Ltd、Kent、Great Britain ）。 ）37°Cで24時間植民地のバイオフィルム層。これらの植民地のバイオフィルムは、対数収縮についてテストされました。
ドレッシングを3 cm2の正方形の断片に切り、滅菌脱イオン水でプレミアステンを入れます。寒天プレートのコロニーのバイオフィルムの上に包帯を置きます。 24 haのバイオフィルムごとに除去され、バイオフィルム内の生存細菌（CFU/ml）は、日中和スープ（Merck-Millipore）で連続希釈（10-1〜10-7）によって定量化されました。 37°Cで24時間インキュベートした後、Mueller-Hinton寒天プレートで標準プレート数を実行しました。各処理と時点は3回実行され、希釈ごとにプレート数が繰り返されました。
豚バラ皮の皮膚は、欧州連合の輸出基準に従って虐殺から15分以内に雌の大きな白い豚から得られます。皮膚を剃毛し、アルコールの拭き取りで洗浄し、次に-80°Cで24時間凍結して皮膚を失望させました。解凍後、1 cm2の皮膚をPBSで3回、次亜塩素酸ナトリウム、70％エタノールで3回洗浄し、毎回20分間洗浄しました。表皮を除去する前に、滅菌PBSで3回洗浄して残りのエタノールを除去します。皮膚は、厚さ0.45μmのナイロン膜（Merck-Millipore）の上に3 mLの吸収性パッド（Merck-Millipore）を含む6ウェルプレートで培養し、10％Dulbeccoの修飾された胎児ウシ血清（Sigma）を含む3 mLの吸収性パッド（Merck-Millipore）イーグル。ミディアム（Dulbeccoの修正されたイーグルミディアム - Aldrich Ltd.）。
植民地時代のバイオフィルムは、バイオフィルム曝露研究のために説明されているように栽培されました。膜上のバイオフィルムを72時間培養した後、滅菌接種ループを使用してバイオフィルムを皮膚表面に塗布し、膜を除去しました。次に、バイオフィルムを37°Cでさらに24時間豚の真皮にインキュベートして、バイオフィルムが豚の皮膚に成熟して接着するようにしました。バイオフィルムが成熟して取り付けられた後、滅菌蒸留水で事前に動かした1.5 cm2ドレッシングを皮膚表面に直接塗布し、37°Cで24時間インキュベートしました。生存可能な細菌は、各外植片の頂端表面に均一に染色生存可能性試薬（Invitrogen、Life Technologies、Paisley、UK）を均一に適用して染色することにより視覚化され、5分間インキュベートしました。ライカDFC425デジタルカメラを使用して、ライカMZ8顕微鏡で画像を即座にキャプチャします。 Image Pro Softwareバージョン10（Media Cybernetics Inc、Rockville、MD Image-Pro（Mediacy.com））を使用して、カラーピンクを定量化しました。以下で説明するように、走査型電子顕微鏡を実行しました。
一晩栽培された細菌は、ミューラー・ヒントンスープで1：100を希釈しました。 200μLの培養物を滅菌0.2μmのwhatman cyclopore膜（Whatman、Maidstone、UK）に加え、Mueller-Hinton Agarにメッキしました。バイオフィルムプレートを37°Cで72時間インキュベートして、成熟したバイオフィルム形成を可能にしました。
3日間のバイオフィルム成熟の後、3 cm2の正方形の包帯をバイオフィルムに直接置き、37°Cで24時間インキュベートしました。バイオフィルム表面から包帯を除去した後、1 mLのプレストブルー細胞生存率試薬（Invitrogen、MA、MA）を各バイオフィルムの表面に20秒間加えました。 Nikon D2300デジタルカメラ（Nikon UK Ltd.、Kingston、UK）を使用して、色の変化を記録する前に表面を乾燥させました。
ミューラー・ヒントン寒天で一晩文化を準備し、個々のコロニーを10 mLのミューラー・ヒントンスープに移し、37°C（100 rpm）のシェーカーにインキュベートします。一晩インキュベートした後、培養物をミューラーヒントンスープで1：100で希釈し、300 µLを0.2 µmの循環Whatman Cyclopore膜（Whatman International、Maidstone、UK）にMueller-Hinton Agarに発見し、72時間以内に37°Cで37°Cでインキュベートしました。 。 。成熟したバイオフィルムは、以下に説明するように創傷に適用されました。
動物とのすべての作業は、マンチェスター大学で、動物福祉および倫理的レビュー局（P8721BD27）によって承認されたプロジェクトライセンスの下で、2012年改訂されたASPAの下で内務省が発行したガイドラインに従って行われました。すべての著者は、到着ガイドラインを順守しました。 8週齢のC57BL/6Jマウス（Envigo、Oxon、UK）をすべてのin vivo研究に使用しました。マウスにイソフルラン（Piramal Cratical Care Ltd、West Drayton、UK）で麻酔をかけ、その背面を剃毛して洗浄しました。次に、各マウスに、スティフェル生検パンチ（Schuco International、Hertfordshire、英国）を使用して2×6 mmの切除創傷を与えられました。バイオフィルムに感染した創傷の場合、損傷直後に滅菌接種ループを使用して、膜の真皮層に記載されているように、膜上に成長した72時間のコロニアルバイオフィルムを適用します。湿った創傷環境を維持するために、1平方センチのドレッシングが滅菌水で事前に動かされています。ドレッシングは各創傷に直接塗布し、3Mテガダームフィルム（3M、ブラックネル、英国）で覆われ、マスティソール液体接着剤（エロクエストヘルスケア、ミシガン州ファーンデール）が適用され、追加の接着が得られました。ブプレノルフィン（アニマルケア、ヨーク、英国）は、鎮痛薬として0.1 mg/kgの濃度で投与されました。スケジュール1の方法を使用して負傷後3日後にマウスをcullし、必要に応じて創傷領域を取り外し、半分にし、保存します。
メーカーのプロトコルに従って、ヘマトキシリン（Thermofisher Scientific）およびEosin（Thermofisher Scientific）染色を実施しました。創傷領域と再上皮化は、Image Pro Softwareバージョン10（Media Cybernetics Inc、Rockville、MD）を使用して定量化されました。
組織切片は、キシレン（Thermofisher Scientific、Loughborough、UK）で脱線し、100〜50％の段階的エタノールで水分補給し、脱イオン水（Thermofisher Scientific）に一時的に浸漬しました。免疫組織化学は、メーカーのプロトコルに従って、Vectastain Elite ABC PK-6104キット（Vector Laboratories、Burlingame、CA）を使用して実行されました。 NIMP-R14（Thermofisher Scientific）およびMacrophages MS CD107B Pure M3/84（BD Biosciences、Wokingham、UK）に対する一次抗体は、ブロッキング溶液中に1：100を希釈し、2つの抗体抗体抗、ベクタステインを添加しました。 ABCおよびVector Nova Redペルオキシダーゼ（HRP）基質キット（Vector Laboratories、Burlingame、CA）、およびヘマトキシリンで対比染色されています。オリンパスBX43顕微鏡とオリンパスDP73デジタルカメラ（オリンパス、サウスエンドオンシー、英国）を使用して画像を取得しました。
皮膚サンプルは、4°Cで24時間、0.1 M HEPES（pH 7.4）で2.5％グルタルアルデヒドおよび4％のホルムアルデヒドで固定しました。サンプルを段階的エタノールを使用して脱水し、定足数K850クリティカルポイントドライヤー（Quorum Technologies Ltd、Loughton、UK）を使用してCO2で乾燥させ、クォーラムSC7620ミニスパッタラー/グロー排出システムを使用してゴールドパラジウム合金でコーティングしました。標本は、FEI Quanta 250走査型電子顕微鏡（Thermofisher Scientific）を使用して画像化して、創傷の中心点を視覚化しました。
ヨウ化物（2μM）を切除したマウス創傷表面に塗布し、37°C（Thermofisher Scientific）で5分間インキュベートし、37°C（Thermofisher Scientific）でSYTO-60（10μM）で処理しました。 15分間のZスタック画像は、ライカTCS SP8を使用して作成されました。
GraphPad Prism V9ソフトウェア（GraphPad Software、La Jolla、CA）を使用して、生物学的および技術的な複製データを集計および分析しました。 Dunnettの事後試験を使用した多重比較による一元配置分析を使用して、各治療と非抗菌コントロールドレッシングの違いをテストしました。 p値<0.05は有意とみなされました。
銀ゲル繊維包帯の有効性は、in vitroで黄色ブドウ球菌および緑膿菌のバイオフィルムコロニーに対して最初に評価されました。銀のドレッシングには、銀の異なる式が含まれています。伝統的な銀のドレッシングは、AG1+イオンを生成します。 EDTA/BCの添加後にAG1+イオンを生成できる銀のドレッシングは、バイオフィルムマトリックスを破壊し、銀の抗菌効果の下で銀に細菌を曝露する可能性があります。イオン15およびAg1+、Ag2+、およびAg3+イオンを生成する酸素化Ag塩を含むドレッシング。その有効性は、ゲル化された繊維から作られた非抗菌制御ドレッシングと比較されました。バイオフィルム内の残りの生存可能な細菌は、8日間24時間ごとに評価されました（図1）。 5日目に、バイオフィルムに3.85×105×105が再構成されました。黄色ブドウ球菌または1.22×105p。バイオフィルムの回復を評価するための緑膿菌。非抗菌コントロールドレッシングと比較して、AG1+ドレッシングは、黄色ブドウ球菌および緑膿菌バイオフィルムの細菌の生存率に5日間にわたって最小限の影響を及ぼしました。対照的に、酸素化AgおよびAg1 + + + EDTA/BC塩を含むドレッシングは、5日以内にバイオフィルム内で細菌を殺すのに効果的でした。 5日目にプランクトン細菌を繰り返し接種した後、バイオフィルムの回復は観察されませんでした（図1）。
黄色ブドウ球菌および銀色の包帯で治療した後の黄色ブドウ球菌および緑膿菌バイオフィルムにおける生存細菌の定量化。黄色ブドウ球菌および緑膿菌のバイオフィルムコロニーは、銀のドレッシングまたは非抗菌コントロールドレッシングで治療され、残っている生存可能な細菌の数は24時間ごとに決定されました。 5日後、バイオフィルムに3.85×105×105が再構成されました。黄色ブドウ球菌または1.22×105p。バクテリオプランクトンPseudomonas緑膿菌のコロニーは、バイオフィルムの回復を評価するために個別に形成されました。グラフは平均+/-標準誤差を示しています。
バイオフィルムの生存率に対する銀のドレッシングの効果を視覚化するために、ドレッシングは、ブタの皮膚Ex vivoで成長した成熟したバイオフィルムに適用されました。 24時間後、ドレッシングを除去し、バイオフィルムを青い反応性染料で染色します。これは、生きたバクテリアによってピンク色に代謝されます。コントロールドレッシングで処理されたバイオフィルムはピンクで、バイオフィルム内の生存性細菌の存在を示しています（図2A）。対照的に、Agオキシソルドレッシングで処理されたバイオフィルムは主に青であり、豚の皮膚の表面の残りの細菌が生存不可能な細菌であることを示しています（図2B）。 Ag1+を含むドレッシングで処理したバイオフィルムで混合青色とピンク色の色が観察され、バイオフィルム内の生存可能で生存不可能な細菌の存在を示しています（図2C）、Ag1+を含むEDTA/BCドレッシングは、ピンクのスポットを持つ主に青でした。銀ドレッシングの影響を受けない領域を示します（図2D）。アクティブ（ピンク）および非アクティブ（青）領域の定量化により、コントロールパッチが75％活性であることが示されました（図2E）。 AG1 + + + EDTA/BCドレッシングは、それぞれ酸素化されたAg塩ドレッシングと同様に機能し、生存率はそれぞれ13％と14％です。 AG1+ドレッシングは、細菌の生存率も21％減少させました。これらのバイオフィルムは、走査型電子顕微鏡（SEM）を使用して観察されました。対照ドレッシングおよびAg1+ドレッシングで処理した後、緑膿菌の層がブタの皮膚を覆って観察されました（図2F、H）、Ag1+ドレッシングで処理した後、ほとんど細菌細胞が見つかりませんでした。コラーゲン繊維は、ブタ皮膚の組織構造と見なすことができます（図2G）。 AG1 + + + EDTA/BCドレッシングによる治療後、細菌のプラークと基礎となるコラーゲン繊維プラークが見えました（図2I）。
シルバードレッシング治療後のPseudomonas緑膿菌バイオフィルムの視覚化。 （A – D）ブタの皮膚で成長した緑膿菌バイオフィルムの細菌の生存率は、銀のドレッシングまたは非抗菌コントロールドレッシングで治療してから24時間後に存在する生存率染料を使用して視覚化されました。生きたバクテリアはピンクで、生存不可能な細菌で、豚の皮は青です。 （e）スキャン電子顕微鏡画像バージョン10（FI）を使用して、ブタ皮膚（ピンクスポット）で栽培された緑膿菌バイオフィルムの定量化、銀ドレッシングまたは非抗菌コントロールドレッシングで24時間処理しました。 SEMスケールバー= 5 µm。 （J – M）植民地時代のバイオフィルムはフィルター上で成長し、銀のドレッシングとの24時間のインキュベーションの後、PrestoBlue反応性染料で染色されました。
ドレッシングとバイオフィルムとの密接な接触がドレッシングの有効性に影響を与えるかどうかを判断するために、平らな表面に置かれた植民地時代のバイオフィルムをドレッシングで24時間処理し、その後反応性染料で染色しました。未処理のバイオフィルムは、色が濃いピンクでした（図2J）。酸素化Ag塩を含むドレッシングで処理したバイオフィルム（図2K）とは対照的に、Ag1+またはAg1+++++++++++++ BCを含むドレッシングで処理されたバイオフィルムは、ピンク染色のバンドを示しました（図2L、M）。このピンク色は、生存可能な細菌の存在を示し、ドレッシング内の縫合領域に関連しています。これらの縫製されたエリアは、バイオフィルム内のバクテリアが生き残ることを可能にする死んだスペースを作成します。
in vivoでの銀のドレッシングの有効性を評価するために、成熟した黄色ブドウ球菌および緑膿菌バイオフィルムに感染したマウスの全厚さ切除された傷を、非抗菌コントロールドレッシングまたは銀のドレッシングで治療しました。 3日間の治療の後、巨視的な画像分析は、非抗菌コントロールドレッシングやその他の銀ドレッシングと比較して、酸素化された塩のドレッシングで治療された場合、より小さな創傷サイズを示しました（図3A-H）。これらの観察を確認するために、創傷を採取し、創傷領域と再上皮化を、イメージプロソフトウェアバージョン10を使用してヘマトキシリンおよびエオシン染色組織切片で定量化しました（図3I-L）。
銀のドレッシングが創傷表面に及ぼす影響と、バイオフィルムに感染した創傷の再上皮化。 （A – H）緑膿菌（A – D）および黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに感染した小さな細胞は、3日間の抗菌コントロールドレッシング、酸素化Ag塩ドレッシング、AG1+ドレッシング、AG1+ドレッシング。代表的な巨視的画像。 AG1 + + EDTA/BCドレッシングを伴うマウスの傷。 （IL）緑膿菌感染症、ヘマトキシリンとエオシンで染色された組織切片、創傷領域と上皮再生を定量化するために使用される組織切片。緑膿菌（M、N）および黄色ブドウ球菌（O、P）バイオフィルム（治療群N = 12）に感染した創傷の創傷面積（M、O）と再上皮化率（N、P）の定量化。グラフは平均+/-標準誤差を示しています。 *平均p = <0.05 **はp = <0.01を意味します。巨視的なスケール= 2.5 mm、組織学的スケール= 500 µm。
緑膿菌バイオフィルムに感染した創傷領域の傷領域の定量化（図3M）は、Agオキシソルトで処理した創傷の平均創傷サイズが2.5 mm2であり、非抗菌コントロールドレッシングの平均創傷サイズは3.1 mm2であることを示しました。真実。統計的有意性に達しました（図3M）。 p = 0.423）。 Ag1+またはAg1++ EDTA/BCで処理した創傷では、創傷面積が減少しませんでした（それぞれ3.1 mm2および3.6 mm2）。酸素化Ag塩ドレッシングによる治療は、非抗菌コントロールドレッシング（それぞれ34％と15％; P = 0.029）およびAg1+またはAg1+++++++ eDTA/BC（10％および11％）（10％および11％）よりも再上皮化を大幅に促進しました。図3N）。 。 、 それぞれ）。
S. aureus biofilmsに感染した創傷では、創傷領域と上皮再生の同様の傾向が観察されました（図3O）。酸素化された銀塩塩を含むドレッシングは、コントロールの非抗菌ドレッシング（2.6 mm2）と比較して、創傷面積（2.0 mm2）を23％減少させましたが、この減少は有意ではありませんでした（P = 0.304）（図3O）。さらに、Ag1+治療群の創傷領域はわずかに減少しました（2.4 mm2）が、Ag1+++ EDTA/BCドレッシングで処理された創傷では創傷領域を減少させませんでした（2.9 mm2）。 AGの酸素塩は、S. aureusバイオフィルム（31％）に感染した創傷の再上皮化を促進しました（31％）。 AG1+ドレッシング（16％、P = 0.903）およびAg+ 1+ EDTA/BCドレッシング（14％、P = 0.965）は、コントロールと同様の上皮再生のレベルを示しました。
バイオフィルムマトリックスに対する銀のドレッシングの効果を視覚化するために、TOTO 1およびSYTO 60ヨウ化染色を実施しました（図4）。 Toto 1ヨウ化物は、バイオフィルムのEPSに豊富な細胞外核酸を正確に視覚化するために使用できる細胞浸透性染料です。 Syto 60は、対比染色として使用される細胞透過性色素です16。緑膿菌のバイオフィルム（図4a-D）と黄色ブドウ球菌（図4i-L）のバイオフィルムを接種した創傷中のヨウ素60ヨウ化液の観察（図4I-L）は、3日間のドレッシング治療の後、バイオフィルムのEPSが大幅に減少したことを示しました。酸素化塩を含むAgおよびAg1 + + EDTA/BC。追加の抗ビオフィルム成分のないAg1+ドレッシングは、緑膿菌を接種した創傷中の細胞のないDNAを有意に減少させましたが、黄色ブドウ球菌を接種した創傷ではあまり効果的ではありませんでした。
対照または銀のドレッシングによる3日間の治療後の創傷バイオフィルムのin vivoイメージング。緑膿菌（A – D）および黄色ブドウ球菌（I – L）の共焦点画像は、細胞外バイオフィルムポリマーの成分である細胞外核酸を視覚化して、TotO 1（緑）で染色しました。細胞内核酸を染色するには、SYTO 60（赤）を使用します。酸。 P.対照および銀のドレッシングによる3日間の治療後、緑膿菌（E – H）および黄色ブドウ球菌（M – P）バイオフィルムに感染した創傷の走査型電子顕微鏡。 SEMスケールバー= 5 µm。共焦点イメージングスケールバー= 50 µm。
走査型電子顕微鏡検査では、緑膿菌のバイオフィルムコロニー（図4E-H）と黄色ブドウ球菌（図4M-P）のバイオフィルムコロニーを接種したマウスが、すべての銀のドレッシングで3日間の治療後、傷の細菌が有意に少ないことが示されました。
バイオフィルム感染マウスの創傷炎症に対する銀の包帯の効果を評価するために、コントロールまたは銀のドレッシングで処理したバイオフィルム感染創傷のセクションは、好中球およびマクロファージに特異的な抗体を使用して免疫組織化学的に染色されました。内部的に好中球とマクロファージの定量的測定。顆粒組織。図5）。すべての銀のドレッシングは、3日間の治療後の非抗菌コントロールドレッシングと比較して、Pseudomonas aeruginosaに感染した創傷の好中球とマクロファージの数を減らしました。ただし、酸素化された銀塩剤ドレッシングによる治療により、試験した他の銀ドレッシングと比較して、好中球（P = <0.0001）およびマクロファージ（P = <0.0001）が大幅に減少しました（図5I、J）。 Ag1+++ EDTA/BCは創傷バイオフィルムに大きな影響を及ぼしましたが、AG1+ドレッシングよりも好ましい栄養素とマクロファージのレベルを低く減らしました。 S. aureusバイオフィルムに感染した中程度の創傷は、Ag（p = <0.0001）、Ag1+（P = 0.0008）、およびAg1 ++ EDTA/BC（P = 0.0043）オキシソールをコントロールと比較して服用した後にも観察されました。同様の傾向が好中球減少症について観察されています。包帯（図5K）。しかし、酸素化Ag塩ドレッシングのみが、黄色ブドウ球菌バイオフィルムに感染した創傷のコントロールと比較して、顆粒組織のマクロファージの数の有意な減少を示しました（P = 0.0339）（図5L）。
好中球およびマクロファージは、非抗菌コントロールまたは銀の包帯による3日間の治療後、緑膿菌および黄色ブドウ球菌バイオフィルムに感染した創傷で定量化されました。好中球（AD）およびマクロファージ（EH）は、好中球またはマクロファージに特異的な抗体で染色された組織切片で定量化されました。 Pseudomonas aeruginosa（I and J）および黄色ブドウ球菌（K＆L）バイオフィルムに感染した傷における好中球（IおよびK）およびマクロファージ（JおよびL）の定量化。 n =グループごとに12。グラフは平均を示しています+/-標準誤差、非抗菌制御ドレッシングと比較した有意値 *はp = <0.05を意味し、**はp = <0.01を意味します。 ***はp = <0.001を意味します。 p = <0.0001）を示します。
次に、感染に依存しない治癒に対する銀のドレッシングの効果を評価しました。非感染切除創傷は、3日間、非抗菌コントロールドレッシングまたは銀ドレッシングで治療されました（図6）。テストされた銀のドレッシングの中で、酸素化された塩ドレッシングで治療された創傷のみが、コントロールで治療された創傷よりも巨視的な画像では小さく見えました（図6a-D）。組織学的分析を使用した創傷領域の定量化により、対照群で治療された創傷の場合、オキシソルドレッシングによる治療後の平均創傷面積は2.35 mm2であることが示されましたが、この差は統計的有意性に達しませんでした（P = 0.488）（図） 。対照的に、対照群と比較して、Ag1+（3.38 mm2、p = 0.757）またはAg1+++++++++++++++++++++++ edta/bc（4.18 mm2、p = 0.054）のドレッシングでの治療後、創傷面積の減少は観察されませんでした。上皮再生の増加は、対照群と比較してAgオキシソルドレッシングで観察されました（それぞれ30％対22％）が、これは重要ではありませんでしたが（p = 0.067）、これは非常に重要であり、以前の結果を確認します。オキシソルのドレッシングは、再上皮化を促進します。 - 感染していない創傷の上皮17。対照的に、Ag1+またはAg1++ EDTA/BCドレッシングによる治療には、コントロールと比較して再上皮化の減少が低下したことが示されました。
完全な切除を伴う感染していないマウスの創傷治癒に対する銀創傷ドレッシングの効果。 （AD）非抗菌コントロールドレッシングと銀ドレッシングによる3日間の治療後の傷の代表的な巨視的画像。 （EH）ヘマトキシリンとエオシンで染色された代表的な創傷切片。創傷面積（I）および再上皮化の割合（J）の定量化は、画像分析ソフトウェア（治療群あたりn = 11〜12）を使用して、創傷の中間点の組織学的切片から計算されました。グラフは平均+/-標準誤差を示しています。 * P = <0.05を意味します。
銀は、創傷治癒における抗菌療法としての長い使用歴がありますが、多くの異なる製剤と送達方法により、抗菌薬の有効性が違いをもたらす可能性があります18。さらに、特定の銀デリバリーシステムの抗中film特性は完全には理解されていません。宿主の免疫応答は浮遊性細菌に対して比較的効果的ですが、一般的にバイオフィルムに対して効果が低いです19。浮遊性菌はマクロファージによって容易に貪食されますが、バイオフィルム内では、凝集した細胞は、免疫細胞がアポトーシスを経験し、炎症性因子を放出して免疫応答を強化できる範囲に宿主の反応を制限することにより、追加の問題を引き起こします20。一部の白血球はバイオフィルムス21を浸透させることができるが、この防御が妥協されると貪食性細菌に浸透できないことが観察されています22。創傷バイオフィルム感染に対する宿主免疫応答をサポートするために、全体的なアプローチを使用する必要があります。創傷の発現は、バイオフィルムを物理的に破壊し、ほとんどのバイオバーデンを除去する可能性がありますが、特に宿主の免疫応答が損なわれた場合、宿主の免疫応答は残りのバイオフィルムに対して効果がない場合があります。したがって、銀のドレッシングなどの抗菌療法は、宿主の免疫応答をサポートし、バイオフィルム感染を排除することができます。組成、濃度、溶解度、および送達基板は、銀の抗菌性の有効性に影響を与える可能性があります。近年、銀加工技術の進歩により、これらのドレッシングがより効果的になりました9,23。シルバードレッシングテクノロジーが進むにつれて、創傷感染の制御におけるこれらのドレッシングの有効性、さらに重要なことには、これらの強力な銀形態が創傷環境と治癒に与える影響を理解することが重要です。
この研究では、2つの高度なシルバードレッシングの有効性を、異なるin vitroおよびin vivoモデルを使用してバイオフィルムに対してAg1+イオンを生成する従来の銀ドレッシングと比較しました。また、これらのドレッシングが創傷環境と感染に依存しない治癒に及ぼす影響を評価しました。送達マトリックスの影響を最小限に抑えるために、テストされたすべての銀のドレッシングは、カルボキシメチルセルロースで構成されていました。
Pseudomonas aeruginosaおよび黄色ブドウ球菌の植民地のバイオフィルムに対するこれらの銀のドレッシングの予備評価は、従来のAg1+ドレッシングとは異なり、2つの進行した銀のドレッシング、Ag1++++++++++++ edta/Bcおよび酸素化Ag塩が5で効果的に発生していることを示しています。数日。さらに、これらのドレッシングは、浮遊性細菌に繰り返しさらされると、バイオフィルムの再形成を防ぎます。 Ag1+ドレッシングには、Ag1+++ EDTA/BCと同じ銀亜塩化銀、塩基マトリックスが含まれており、同時期にバイオフィルム内の細菌の生存率に限られた影響を及ぼしました。 AG1+++++ EDTA/BCドレッシングは、同じマトリックスと銀の化合物で構成されるAG1+ドレッシングよりもバイオフィルムに対してより効果的であるという観察は、報告されているように、バイオフィルムに対する塩化銀の有効性を高めるために追加の成分が必要であるという概念をサポートしています。他の場所15。これらの結果は、BCとEDTAが全体的なドレッシングの有効性に寄与する追加の役割を果たし、AG1+ドレッシングにこのコンポーネントがないことがin vitroの有効性を実証できないことに貢献した可能性があるという考えを支持しています。 Ag2+およびAg3+イオンを生成する酸素化されたAg塩ドレッシングは、Ag1+よりも抗菌効果が強く、Ag1+++ EDTA/BCと同様のレベルで示されることがわかりました。ただし、酸化還元の可能性が高いため、Ag3+イオンがどのくらいの期間アクティブであり、創傷バイオフィルムに対して効果的であるかは不明であるため、さらなる研究に値します。さらに、この研究ではテストされていないAg1+イオンを生成する多くの異なるドレッシングがあります。これらのドレッシングは、さまざまな銀色の化合物、濃度、およびベースマトリックスで構成されており、Ag1+イオンの送達とバイオフィルムに対する有効性に影響を与える可能性があります。また、バイオフィルムに対する創傷ドレッシングの有効性を評価するために使用される多くの異なるin vitroおよびin vivoモデルがあることも注目に値します。使用されるモデルのタイプと、これらのモデルで使用される培地の塩およびタンパク質含有量は、ドレッシングの有効性に影響を与えます。私たちのin vivoモデルでは、バイオフィルムがin vitroで成熟することを許可し、それを創傷の真皮表面に移しました。宿主マウスの免疫応答は、創傷に適用される浮遊性細菌に対して比較的効果的であり、それにより創傷が治癒するにつれてバイオフィルムが形成されます。創傷に成熟したバイオフィルムを追加すると、成熟したバイオフィルムが治癒が始まる前に創傷の中に自分自身を確立できるようにすることにより、バイオフィルム形成に対する宿主の免疫応答の有効性が制限されます。したがって、我々のモデルにより、傷が治癒し始める前に、成熟したバイオフィルムに対する抗菌包装の有効性を評価することができます。
また、ドレッシングフィットは、in vitroで成長したバイオフィルムとブタの皮膚に対する銀のドレッシングの有効性に影響を与えることがわかりました。創傷との密接な接触は、ドレッシング24,25の抗菌性の有効性にとって重要であると考えられています。酸素化Ag塩を含むドレッシングは、成熟したバイオフィルムと密接に接触しており、24時間後にバイオフィルム内の生存可能な細菌の数が大幅に減少しました。対照的に、Ag1+およびAg1++++++ BCドレッシングで治療すると、かなりの数の生存細菌が残っていました。これらのドレッシングには、ドレッシングの全長に沿った縫合糸が含まれており、バイオフィルムとの密接な接触を防ぐデッドスペースが作成されます。私たちのin vitro研究では、これらの非接触領域は、バイオフィルム内の生存性細菌の殺害を妨げました。 24時間の治療後にのみ細菌の生存率を評価しました。時間が経つにつれて、ドレッシングがより飽和するにつれて、死んだスペースが少なくなり、これらの実行可能な細菌の領域が減少する可能性があります。ただし、これはドレッシングの銀の種類だけでなく、ドレッシングの組成の重要性を強調しています。
in vitroの研究はさまざまな銀技術の有効性を比較するのに役立ちますが、宿主組織と免疫応答がバイオフィルムに対するドレッシングの有効性に寄与するin vivoのバイオフィルムに対するこれらのドレッシングの影響を理解することも重要です。創傷バイオフィルムに対するこれらのドレッシングの効果は、細胞内および細胞外DNA染料を使用した走査型電子顕微鏡とバイオフィルムのEPS染色を使用して観察されました。 3日間の治療の後、すべてのドレッシングはバイオフィルム感染創傷の細胞のないDNAを減らすのに効果的であることがわかりましたが、AG1+ドレッシングは黄色ブドウ球菌に感染した創傷であまり効果的ではありませんでした。走査型電子顕微鏡検査では、銀のドレッシングで処理された創傷には著しく少ない細菌が存在することが示されましたが、これはAG1+ドレッシングと比較して酸素化されたAg塩ドレッシングとAG1++ EDTA/BCドレッシングでより顕著でした。これらのデータは、テストされた銀のドレッシングがバイオフィルム構造にさまざまな影響を与えたことを示していますが、銀のドレッシングはどれもバイオフィルムを根絶することができず、創傷バイオフィルム感染の治療に対する全体的なアプローチの必要性をサポートしています。シルバーアームバンドの使用。治療の前には、ほとんどのバイオフィルムを除去するための物理的な壊加工が行われます。
慢性創傷はしばしば重度の炎症の状態にあり、過剰な炎症細胞は創傷組織に長期間残り、組織の損傷を引き起こし、創傷性の細胞代謝と機能に必要な酸素を枯渇させます26。バイオフィルムは、細胞増殖の阻害と炎症誘発性サイトカインの活性化など、さまざまな方法で治癒に悪影響を与えることにより、この敵対的な創傷環境を悪化させます27。銀のドレッシングがより効果的になるにつれて、創傷環境と治癒に与える影響を理解することが重要です。
興味深いことに、すべての銀のドレッシングはバイオフィルムの組成に影響を与えましたが、酸素化された銀塩のドレッシングのみがこれらの感染した創傷の再上皮化を増加させました。これらのデータは、以前の調査結果とKalan et alの調査結果をサポートしています。 （2017）28は、酸素化された銀塩の良好な安全性と毒性プロファイルを実証しました。
私たちの現在の研究は、抗菌薬銀ドレッシングの間の銀技術の違いと、創傷環境と感染に依存しない治癒に対するこの技術の影響を強調しています。ただし、これらの結果は、AG1 + + + + EDTA/BCドレッシングがin vivoでの負傷したウサギの耳の治癒パラメーターを改善したことを示す以前の研究とは異なります。ただし、これは、動物モデルの違い、測定時間、および細菌の応用法による可能性があります29。この場合、傷測定は損傷後12日後に採取され、ドレッシングの有効成分がより長い期間にわたってバイオフィルムに作用することができました。これは、AG1 + + + EDTA/BCで治療された臨床的に感染した脚潰瘍が1週間の治療後に最初にサイズが増加し、その後AG1 + + EDTA/BCでの次の3週間の治療と4週間以内にサイズが最初に増加したことを示した研究によってサポートされています。非抗菌薬の使用。薬物。潰瘍のサイズを縮小するためのCMCドレッシング30。
銀の特定の形態と濃度は以前にin vitro 11で細胞毒性であることが示されていますが、これらのin vitroでの結果は、in vivoの副作用に常に変換されるとは限りません。さらに、銀技術の進歩と銀の化合物のより良い理解とドレッシングの濃度は、多くの安全で効果的な銀のドレッシングの開発につながりました。しかし、銀ドレッシング技術が進むにつれて、これらのドレッシングが創傷環境に与える影響を理解することが重要です31,32,33。再上皮化速度の増加は、炎症誘発性M1表現型と比較して抗炎症M2マクロファージの割合の増加に対応することが以前に報告されていました。これは、銀ヒドロゲルの創傷ドレッシングが銀スルファジアジンおよび非抗菌ヒドロゲルと比較された以前のマウスモデルで認められました34。
慢性創傷は過度の炎症を示す可能性があり、過剰な好中球の存在が傷の治癒に有害である可能性があることが観察されています35。好中球枯渇マウスの研究では、好中球の存在が再上皮化を遅らせました。過剰な好中球の存在は、慢性およびゆっくりした癒しの創傷に関連するスーパーオキシドや過酸化水素などの高レベルのプロテアーゼと反応性酸素種につながります37,38。同様に、マクロファージの数の増加は、制御されていない場合、創傷治癒の遅延につながる可能性があります39。マクロファージが炎症誘発性の表現型からプロヒール促進表現型に移行できず、創傷が治癒の炎症段階を出ることに失敗した場合、この増加は特に重要です40。すべての銀のドレッシングで3日間の治療後にバイオフィルム感染した創傷の好中球とマクロファージの減少が観察されましたが、酸素化された塩のドレッシングで減少はより顕著でした。この減少は、銀に対する免疫応答、バイオバーデンの減少に対する反応、または治癒の後期段階にあるため、創傷の免疫細胞が減少する直接的な結果である可能性があります。傷の炎症細胞の数を減らすと、創傷治癒に役立つ環境を維持する可能性があります。 Agオキシソルトが感染に依存しない治癒を促進する方法の作用メカニズムは不明ですが、Agオキシソルトが酸素を生成し、炎症のメディエーターである過酸化水素の有害レベルを破壊する能力は、これを説明し、さらなる研究を必要とする可能性があります17。
慢性非治癒感染した創傷は、医師と患者の両方に問題を引き起こします。多くのドレッシングは抗菌薬の有効性を主張していますが、研究が創傷微小環境に影響を与える他の重要な要因に焦点を当てることはめったにありません。この研究は、異なる銀技術が異なる抗菌薬の有効性を持ち、重要なことに、感染とは無関係に、創傷環境と治癒に異なる影響を与えることを示しています。これらのin vitroおよびin vivoの研究は、創傷感染の治療と治癒の促進におけるこれらの包帯の有効性を示していますが、クリニックでのこれらのドレッシングの有効性を評価するには、ランダム化比較試験が必要です。
現在の調査中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的なリクエストで対応する著者から入手できます。
投稿時間：7月15日 - 2024年